ELISA三种常见测定方法及原理分析

  酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种使用酶标仪进行测定的免疫测定法，用于检测和定量生物分子，例如抗体、蛋白质、激素或肽，以及表征蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用。在ELISA中，将用于实验的靶标（通常是抗原）固定在固体表面上，然后用辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AP）的酶缀合抗体进行仔细的检测。通过与被酶催化的底物孵育来实现定量，由此产生可测量的副产物。

  ELISA测定法通常在96孔板中进行。这些板被设计成通常通过直接吸附到微量滴定板的表面上或间接地通过预先包被的抗体间接地结合和固定抗原。固定后，将一抗引入样品中，与抗原形成免疫复合物。一抗可以共价标记到酶（例如HRP）上，或者如果一抗被生物素标记，则一抗本身能使用酶标记的二级抗体或链霉亲和素偶联物间接检测。通过与合适的底物孵育来评估共轭酶的活性，以此来实现检测，该底物会产生可测量的副产物。试剂盒在灵敏度和成像设备的兼容性方面各不相同。

  在ELISA中检测一级抗体-抗原复合物的办法能够是直接的或间接的（图1）。在直接检测的新方法中，与报告酶（例如HRP或AP）缀合的单一一抗可以直接检测靶抗原。通过间接检测，可以依次使用双抗体系统检测目标靶标。首先，将样品与针对目标抗原的未标记一抗孵育。然后，使用一抗特异的酶标二抗检测其存在，从而检测靶抗原。若使用生物素化的一抗检测抗原，则使用酶标记的抗生蛋白链菌素偶联物作为您的第二检测试剂。

  使用哪种检测的新方法取决于靶抗原的表达水平。为经验测试高度表达的抗原，直接检测是合适的方法。当灵敏度至关重要时，例如检测低丰度靶标或表达不良的抗原，请使用间接检测的新方法来增强信号。

  在直接ELISA中，抗原通过被动吸附直接固定在板的表面，并使用HRP标记的一抗进行仔细的检测。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。在所有ELISA法中，直接ELISA分析最简单，执行最快，但灵敏度最低。

  间接ELISA本质上是直接ELISA的修改版本。在间接ELISA中，用于检测抗原的一抗是未偶联的。取而代之的是，对一抗的宿主物种具有反应性的酶标二级抗体被用于检测一抗-抗原复合物（间接检测抗原）。将无色底物引入样品，该底物与酶结合物反应，并产生可测量的副产物。根据底物的选择，该副产物可以是比色的，化学发光的或荧光的。信号产生的大小与样品中抗原的数量成正比。与直接ELISA相比，使用辅助检测试剂有着非常明显的优势，即信号放大。

  夹心ELISA分析是最常用的ELISA形式。它需要用匹配的抗体对，从而每种抗体对抗原上不同的非重叠表位具有特异性。首先将一种抗体，称为捕获抗体，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促进靶抗原的固定。然后，第二种抗体（称为检测抗体）与捕获抗体-抗原复合物结合。最后，添加对检测抗体（而非捕获抗体）具有特异性的酶标记的第二抗体偶联物。