发布日期： 2024-07-03 05:05:09 来源：ELISA试剂盒
微生物摄影算是专业摄影范畴，不仅要掌握摄影知识，还有必要了解本专业的相关知识，这样才能拍出专业特色的作品来。
专题-「实验室诊断技术导航」版块 作者：陈东科 单位：海南省，三亚市人民医院/四川大学华西三亚医院检验科
医学微生物学是一门与临床紧密关联的学科，也是检验医学重要的一部分。随着自动化微生物鉴定仪、质谱分析仪和分子生物学等方法在临床微生物实验室的普及和应用，为微生物检验工作者对病原微生物的快速诊断和药敏试验提供了有力工具，但至今尚无一个鉴定系统能包括所有的微生物鉴定资料和信息。没有完美的方法学，需要多个方法学参考验证。微生物的形态、染色以及特殊结构是最基本的分类依据，通过种种鉴定系统得出的结果，必须与已获得的生物学性状(如标本来源、菌体形态及染色性、菌落特征及其他的生理生化特征）进行核对，才能避免错误鉴定的发生。
形态学检验对微生物鉴定具有导航的作用，正确的形态学检验结果是准确鉴定细菌(真菌)的坚实基础。作为基本功的形态学知识，是每一位微生物检验技术人员一定掌握的技能。在实际在做的工作中微生物形态学图片的用途十分普遍，如临床涂片报告(图文报告)、鉴定仪器的专家系统、室间质量评价、教学、资料保存、学习交流、发表论文、编辑图谱等都需要清晰的图片。因此，学会拍摄微生物图片也成为了临床微生物检验人需要掌握的技能之一。
临床微生物检验摄影是指对由各种微生物引起感染性疾病的相关图片拍摄，主要拍摄范围包括患者的感染部位、标本性状、病原体(细菌、真菌、寄生虫等)、病原菌宿主、标本涂片镜检结果(染色或不染色)、菌落特征、纯菌涂片镜检结果(包括菌体的特殊结构等)、生化反应及辅助试验结果、药敏试验及耐药机制检测的表型结果等。细菌(真菌)形态学包括细胞形态学和菌落形态学。
拍摄前要掌握一定的形态学知识和摄影基本知识，标本涂片的制备很重要也很关键，染色技术要过关，培养基及孵育条件直接影响到对菌落形态的观察，显微放大设备(显微镜等)、摄影器材等设备是不可或缺的。
1.学习和掌握形态学知识：不同病原体有不同或相近的形态特征，即使是同一种病原体在不同环境中形态也会不同。因此，了解病原体的基本结构、分类和命名的原则，对我们正确地识别重要病原非常有帮助。相关的国内外参考书有《医学重要真菌鉴定指南》、《真菌病诊断与治疗》、《THE YEASTS A TAXONOMIC STUDY》、《实用临床微生物学检验与图谱》等，还有无纸化的《临床微生物学检验图谱》等。
2.标本涂片的制备：无论是染色片还是不染色片，均要求制成单细胞层的厚度为宜。要拍出病原体在标本中的生存状态、形态特征及染色特性，制片十分重要。制片的根本原则是尽可能保持标本中组织细胞的结构不被破坏，涂片的厚度要求是单层细胞、均匀一致，这样的片子染色后整片着色均匀一致、细胞核与细胞浆清晰、菌体是被吞噬或是粘附可辨，这是图片拍摄对制片的基本要求。
3.染色技术：不同的病原体对染料的亲和力不完全一样。按照染色液说明书里面的操作要求做，同时用质控片进行质控，以质控片达标为准。使用自动染片机的用户应根据制片的厚薄采用不一样的程序进行染色，同时用质控片进行质控。革兰染色质控片制备：取一种革兰阳性菌和一种革兰阴性菌，例如金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌（推荐用ATCC标准菌株），各配置2麦氏浊度单位浓度的菌液，两菌液混匀后挑取一接种环涂成直径为1.5cm的菌斑，晾干，固定后备用。其他染色方法的质控片，可选相应的阳性菌株或标本经灭活后制备。
4.菌株准备：对于细菌（真菌）形态学的正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。观察细菌(真菌)的典型形态，应该是将细菌（真菌）接种在该菌最适生长的培养基上、放入该菌最适生长环境中(包括温度、湿度和所需气体条件等)进行孵育，孵育时间应视该菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24h为宜，有些细菌(真菌)需要更长时间的孵育才能显现出典型的菌落特征。有时为鉴别某一种或某一类细菌(真菌)，需要观察细菌在特殊的培养基(包括显色培养基)上或在特定环境下(气体、温度和光线等)培养的形态特征。
5.显微放大设备：“微”生物，就是人们用肉眼观察时看不见的生物。我们要想办法把我们的拍摄对象放大数百上千倍，一般的相机达不到这个要求，必须借助放大设备（放大镜或显微镜）才能完成。
6.显微摄影对显微镜的要求：要安设图像采集器或照相机的用户，必须准备三目显微镜。二目或一目显微镜只适用于采用经目镜拍摄的用户。目前多见的是三目显微镜加上一个采集系统（如图1）。图1右侧展示的是教学显微镜，也可以投屏供多人观看。预算不够也可以将数码相机捆到显微镜目镜上进行拍摄（如图2）。不过，更多人青睐于手机摄影，为了生物安全考虑，可以配备一个专用手机在实验室内使用。
7.摄影器材：工欲善其事，必先利其器。要拍出理想的图片，就必须有适手的摄影器材，才可以做到事半功倍的效果。随着数码时代的到来，微生物摄影如虎添翼，摄影设备有了质的飞跃，各式各样的专业设备应运而生，品种繁多。各实验室应根据实验室条件和经济实力购买适当的摄影器材，最低配置应该至少能拍出达到打印图文报告和出版要求的图片（不小于300kb/图）。拍摄用的显微镜图像采集系统应配置像素不低于1000万的电子摄像头。目前市场上的数码相机像素都在1000万以上，完全适用于细菌图片的拍摄需要。一般实验室常将显微镜下图像通过采集设备投屏到显示器屏幕上方便多人观看（如图1右）。而病理科因玻片存储容量问题，运用图片扫描仪将玻片扫描成高清数码图片存储起来，可以每时每刻放大查看细节，也可以标注。但是这样拍出的图片都在1G以上，需要强大的传输和储存设备。皮肤镜的放大倍数有好几百倍，且有照明，这样的产品也适用于微生物的拍摄。笔者日常工作中拍摄使用的是一个数码相机，配备一个特殊的转接镜头，连接到显微镜上进行拍摄。在此之前是用数码相机对着目镜进行拍摄（如图2）。
8.手机拍摄辅助器：在实际在做的工作中，最方便的是用手机直接进行拍摄（方便交流），但是用手机拍摄显微镜下图片时遇到的最严重的问题是手持拍摄不稳定，尤其新手，抓屏困难，对焦不准，很难拍到符合标准要求的图片。手持拍摄需要一定的技巧和训练，寻找支撑点，掌握要领后也可以拍出不错的图片。但现实情况不尽如人意。根据这样的一种情况，笔者发明了一系列相应的辅助器。起初为固定手机，将纸卷成高度适宜的纸筒（不一样的品牌的手机对高度的要求有差异）套在目镜上，将手机摄像头抵在纸筒上增加稳定性来拍摄，这种纸筒可以卷几个不同的高度和粗细适应不一样的手机型号和不相同的型号的目镜，此纸筒被称为“第一代神器”（如图3），但是有些检验人员依然不能使用它拍摄出清晰的图像。于是“第二代神器”—DongKe LENs应运而生（如图4），DongKe LENs系统包括DongKe LENs、10*目镜、蓝牙遥控器和铁片（粘在手机背面固定手机用），将手机利用磁铁吸附在辅助器上，仅用手指即可在屏幕上做相关操作（放大和拍照等），尤其是拍摄动态的图片（如寄生虫）和视频时很稳定，拍摄效果清晰。使用电子设备拍摄辅助器是不错的选择，从简易的纸筒辅助拍摄器发展到固定式的辅助拍摄器，现在用手机拍摄已不成问题，而且经济、简单易操作方便，对基层单位是不错的选择。“三代神器”是一种简化的高清采集器（如图5），可以插卡、用蓝牙传送到手机上、用线路传至电脑上。
9.菌落拍摄器材：菌落拍摄难度要大于镜下拍摄，尤其是小菌落、凹陷菌落、扩散生长菌落、绒毛样菌落等，自动拍摄很难准确对焦，拍摄时需要运用到很多微距摄影技术与技巧，需要长期的训练才能拍摄自如。为方便拍摄，相应的拍摄装置也应运而生（如图6），很多实验室使用的是这套设备，价格相对便宜，但无法控制污染。为符合生物安全要求，第四代神器（菌落拍摄专用设备）考虑到生物污染的问题，采用密闭式拍摄箱（如图7），内置灯光，上方有孔可用于手机摄像头拍摄。而改进后的第五代神器类似于生物安全柜的样式（如图8），关上门能形成封闭的空间，手摇可调节角度，内置紫外消毒灯。第六代神器更加小型化（如图9），内置环形灯和可调角度的平皿支架，可多角度拍摄。第七代神器可以将平皿自动送进送出，添加软件后可支持纸片法药敏直径的测量和自动判读结果。
10.摄影基本知识：曝光、对焦和构图是摄影的三要素。曝光4要素：光线、光圈、快门和感光度，光线越强照片越明亮，光圈越大越明亮，快门越慢越明亮，感光度越高越明亮。光线个特征：强度、方向和色温，强度是指亮不亮，方向是指光从哪里来，色温是指光源发射光的颜色与黑体在某一温度下辐射光色相同时，黑体的温度称为该光源的色温。光线个类型：自然光、场景光和人造光，自然光光谱范围广，色彩还原最佳。场景光往往指拍摄现场所有可用的光源发出的光，光源复杂、强度较弱。人造光指人工设计制造的仪器、设备产生的光，如日光灯的光、激光等，常用的人造光设备如闪光灯。景深3要素：光圈、焦距和对焦距离，光圈越大景深越浅，焦距越长景深越浅，对焦距离越近景深越浅（背景越模糊）。感光度：是指胶片或感光器对光的灵敏程度，用ISO表示。感光度越高，对光线越敏感。高感光度下的图像细节损失造成了照片不清晰。相反，感光度低，图像噪点减少，画质细腻。
对焦是指通过改变镜头与感光器之间的距离，让某一个特定位置的物体通过镜头的成像焦点正好落在感光器之上，得出最清晰的影像。对焦不准确，则拍摄的图片不清晰。
构图是指如何把人、景、物安排在画面当中以获得最佳布局的方法。构图的目的是对拍摄的主题加以强调突出。
每个实验室至少培养1~2位懂摄影的技术人员才能更好地胜任图片收集工作。更为深入的知识可参阅有关专业书籍进行学习。
对于不同的拍摄对象，要采用不一样的拍摄办法来进行拍摄，拍摄技巧的掌握与应用可以大幅度提高图片的质量。图片的质量不单单是把拍摄对象拍清楚这么简单，要求图片能表现出被拍摄对象的特征，哪怕是细微的特征也要求表达出来，这对于菌株间的鉴别可能是至关重要的。
1.感染部位拍摄：有些病原体感染人体后会产生特殊的体征，如麻风、皮肤炭疽、猩红热、葡萄球菌皮肤烫伤样综合征、麻疹、干性或气性坏疽、真菌性角膜炎、软下疳、梅毒、鹅口疮、白喉、破伤风、糠秕疹(由马拉色菌引起)、孢子丝菌病(“玫瑰手”)、黄癣(由许兰毛癣菌引起)、黑癣(由紫色毛癣菌引起)、叠瓦癣(由同心性毛癣菌引起)、足肿病、囊虫病、血吸虫病、丝虫病等，对于鉴别诊断具有指导意义。因此对于感染部位的拍摄显得十分重要。拍摄前需要对感染部位做评估，选择最有代表性的部位进行拍摄。要求对焦要准确，在光线充足的地方进行拍摄，最好是自然光，如果现场光线达不到直接拍摄的要求，可采用辅助光进行拍摄，如台灯等可移动灯具或是使用闪光灯，使用闪光灯要注意距离和角度，避免曝光过度。
2.标本的直接涂片镜检结果拍摄：标本的直接涂片镜检对于感染性疾病病原的诊断有重要的意义，是一种快速、简便、有效的微生物检验手段。可为临床医生早期诊断、合理的经验选用抗菌药物提供参考依据。
（1）不染色标本拍摄：不染色标本涂片通常是采用直接压片的方法制片，一般只在低倍或高倍镜下观察，很少使用油镜观察。因此，调节适当的光亮对拍摄图片的成功与否十分重要，将显微镜的聚光器下调到适当位置，以获得最佳亮度，此时被拍摄对象的轮廓及层次清晰分明（如图10）。
图10（1）图片拍摄：由于不进行染色，病原体与背景的色差不大，需要调节聚光器，以突出病原体。拍摄寄生虫等较大个体时必须要格外注意细节，寄生虫相对于真菌和细菌个头算大的，个体大于10mm可直接用微距镜头进行拍摄，但细节表现不会太好，建议在显微镜下拍摄细节部分。由于个体大、厚度高，要想用一个镜头拍摄完整虫体几乎不可能，只能分层拍摄，或是将虫体压扁后进行拍摄。要拍摄虫体器官，一定要进行染色。寄生虫拍摄的重点在口器、尾器、交合器和脏器的细节，虫卵拍摄也同样要注重卵内细节，如钩虫卵的卵膜和齿、鞭虫卵的核、蛔虫卵的膜等（如图11）
图11（2）动态视频拍摄：适用于活体标本的直接镜检拍摄，如细菌运动方式、阿米巴滋养体、蓝氏贾第鞭毛虫、滴虫、纤毛柱状上皮细胞等。要求标本新鲜(必要时保温)，拍摄要稳(建议固定拍摄，手持拍摄不稳)，实时调焦(即跟随拍摄)
（2）染色标本拍摄：拍摄前，先对整张涂片进行观察，选择最具代表性的视野进行拍摄，每个视野可调节不同焦距面进行拍摄，在不同层面上反映出病原体在标本中的状态，对大小不同的拍摄对象应选用不同的物镜头进行拍摄，尽量拍出其完整性（如图12、图13）。
（3）菌落的拍摄：细菌和真菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小(分大、中、小，菌落直径以1mm为界)、形状、高度、边缘、表面状态、密度(透明度)、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血和色素产生情况等特性。观察菌落特征的目的是为了对细菌和真菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌和真菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝样菌落（如图14左）、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落（如图14右）、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落，酵母型真菌、酵母样真菌、丝状真菌等。
（4）色素拍摄：观察细菌和真菌色素的产生，最好是在没有颜色的培养基上进行培养，如营养琼脂、 MHA、PDA、察氏琼脂等，尤其不能在显色培养基上进行观察，以减少背景颜色对真实颜色的干扰。拍摄前的构思很重要，要根据不同菌落特性选不一样的拍摄方法，要求拍出菌落的主要特征和局部细节，拍出的菌落不变形，菌落颜色要保线），要标注放大倍数避免误导读者。
（5）特写镜头拍摄：对菌落局部细节的拍摄可能要借助放大镜或显微镜来完成，辅助光的应用是必须的，最好使用专业光源，也可使用台灯，但要注意颜色的保真，适时调节白平衡(可设置成自动调节)。为越来越好的突出菌落特征（如图16），建议选择正真适合的背景颜色(即平板放置平台的颜色)，背景颜色选择的根本原则是深色平板(指琼脂颜色)用浅色背景，如血平板选用白色背景;浅色平板选择深色背景，如营养琼脂平板或SDA平板等应选择黑色或蓝色背景。
拍摄大菌落(菌落直径1mm)时可拍全平板，拍摄小菌落(菌落直径1mm)时最好拍摄菌落分布较均匀的局部。拍摄菌落特征时可针对单个菌落进行拍摄，必要时可借助放大镜或在显微镜下拍摄。拍摄菌落内部结构时需要采用透射光（逆光）进行拍摄。
（6）纯菌体镜下形态拍摄：细菌镜下拍摄要留意选择菌量适中、染色良好、具有典型形态特征的视野进行拍摄，对菌体特殊结构的拍摄要求充足表现出具体特征，如龋齿罗氏菌菌体末端膨大、丹毒丝菌菌体呈长链状排列、芽胞的形状及在菌体中的位置及染色特性等(细菌的芽胞建议在相差显微镜下直接拍摄，其效果好于芽胞染色)、细菌荚膜的厚度及着色情况、鞭毛的位置和数量等(细菌的鞭毛很细，非常考验拍摄水平，要认真对焦，否则很难拍摄成功)。
（7）真菌镜下拍摄：真菌镜下拍摄也分为不染色和染色两种情况。不染色主要是拍摄真菌自然的生长状态，如对菌落的直接镜下拍摄、对小培养的直接镜下拍摄及对假丝酵母菌血清芽管试验的镜下拍摄等（如图17）。染色标本主要是对丝状真菌乳酸酚棉蓝染色后的镜下拍摄和对非丝状真菌的革兰染色镜下拍摄。拍摄时最优选择各种典型特征汇聚在一起的视野，尽量拍摄具有特征性的视野。由于真菌个体较大，拍摄时要注意景深，选择正真适合的物镜头很重要，不同焦距面都要拍下来，能够清晰地显示菌丝、足细胞、孢子梗、囊托、分生孢子等。要拍摄出丝状真菌的典型生长状态，最好是选择小培养制片进行拍摄。
（8）生化反应及辅助试验结果的拍摄：生化反应及辅助试验结果的拍摄并不比菌落的拍摄容易，根据不同的试验结果需要用不同的拍摄技术。如细菌动力、拉丝试验、荧光素检测、CAMP、触酶试验、紫外线吸收试验、毛发穿孔试验等，拍摄这些结果对技术的应用也不同，如光照角度、光源等。例如生化结果要拍清楚颜色；触酶试验需拍出气泡是在菌落上产生还是在琼脂上产生；不同的溶血方式显示准确；紫外光吸收试验：甲基杆菌在紫外灯照射时显示为黑色，其他菌例如玫瑰单胞菌不吸收紫外光不显示颜色；黏液丝实验需要对焦到黏液丝上；好氧实验中菌的生长方式是表面生长、浑浊生长还是沉淀生长；盐水漂浮试验要将焦距对准菌膜拍摄等，比较考验技术。
（9）药敏试验及耐药机制检测结果的拍摄：拍摄需要用肉眼判定结果的药敏试验及耐药机制检测结果时，一定要能在图片中如实反映出结果的细节部分，使读者可以依据图片也能准确判定结果。如药敏试验结果中的弱生长现象、耐药机制检测试验结果中的抑菌圈边缘试验、协同或抑制试验等（如图18）。
（10）病原宿主的拍摄：对宿主的准确辨认能提示医生对病原的推测，并进行有关检测和经验治疗，包括病原微生物、昆虫、动物等（如图19）。
1.色彩还原准确：色彩还原指拍摄的图片显示出来后，彩色摄影画面的色彩大体上和原景物的色彩相一致。影响色彩还原的因素有相机的性能、摄影镜头的质量、光线的色温、洗印条件、印片光号、显示器质量等。
2.比例尺应用的必要性：要准确地反映被拍摄物体的真实大小，最简单有效的办法是在图片上加比例尺。但这需要相当高的技术。有些专用的相机及显微镜配有比例尺，一般的设备不具备。这就要求拍摄者在拍摄时注意记录拍摄时的放大倍数，当然不只是物镜乘以目镜放大倍数这么简单，实际上还必须要格外注意相机变焦及图片后处理时的裁减等因素，总之要尽可能准确，并在图片中注明放大倍数，否则会误导读者。
3.光线应用的技巧：摄影就是光的艺术，不会用光是拍不出好作品的。尤其是对菌落的拍摄，应该根据菌落的特征以及拍摄者要反映出的效果来选择用光，测光和逆光也是常用的手段（如图20~图22），运用好能拍是极佳的效果。例如拍摄液体里的东西需要侧光和侧逆光；拍溶血性可以用透射光（逆光）拍摄，溶血效果更明显。
4.荧光拍摄技巧：荧光是激发光，亮度较高，拍摄时将亮度调节到合适位置再进行拍摄。
微生物摄影算是专业摄影范畴，不仅要掌握摄影知识，还有必要了解本专业的相关知识，这样才能拍出专业特色的作品来。拍摄者的体检结果应符合医学检验从业人员的体检标准，色盲、色弱者不适合进行彩色图片的拍摄工作。
1.保证图片的质量：一张合格的图片应该是图像清晰、颜真、主题突出、背景干净、像素符合出版要求。图像清晰主要是要求焦距准确、曝光充分、防颤抖，颜真要求拍摄辅助光接近自然光、适时调准白平衡，主题突出就是要合理构思把最具典型特征的部位放在醒目位置、必要时加箭头指示。拍摄菌落和其他辅助试验结果时是要注意保持背景干净，背景要防止窗户、门框、桌椅等，平板背面最好还是不要用记号笔写字，否则影响到菌落的颜色、溶血等特性的展示。
2.生物安全保障：所有拍摄过程均要符合实验室生物安全要求。拍摄菌落最好在生物安全柜中进行，摄影器材不要带出实验室，图片可通过实验室电脑进行远程传输，也可蓝牙无线传输图片。若使用手机进行拍摄，最好是实验室配置的专用手机，个人的手机严禁带入实验室。
3.兴趣培养与技能训练：摄影是一门独立的学科，摄影理论知识、实践摄影拍摄、绘画基础，这三科是摄影专业一定要具有的基本素质。要想拍出好作品不是简单的按快门这么简单，需要培养兴趣，更需要长期的技能训练。建议拍摄者日常多在自然状态下进行拍摄训练，尤其是对微距拍摄的训练，如拍摄花、鸟、鱼、虫等小的景物，一是能大大的提升摄影的兴趣，二是可以陶冶情操，三来可以将实战技巧运用于实际在做的工作中来，拍出更生动详实的作品。