真菌药敏检测技术大盘点

  针对目前真菌药敏手工操作繁琐、肉眼结果判读难以标准化等问题，全自动真菌药敏试验解决方方案用独家专利荧光显色技术，微流控盘式设计以及自动实时动态检测抗菌药物作用后病原菌的增殖情况。

  事实上真菌感染正成为一个日益严重的问题，引起疾病的人数持续不断的增加，对全球公共卫生安全构成威胁。据估计，全世界有超过10亿人患有真菌疾病。严重的真菌感染，如侵袭性念珠菌病，甚至会威胁生命。

  2022年10月25日，世界卫生组织发布警告称，由于新冠肺炎疫情、真菌耐药性增加和免疫功能低下患者增多，人们被真菌感染的风险正在飙升。为了应对这种一直上升的威胁，世卫组织公布了一份由19种致命真菌构成的“真菌病原体名单”。最危险的四种真菌分别为：新型隐球菌、烟曲霉、白色念珠菌和耳念珠菌，高度耐药、并在整个世界引发多起疫情。

  真菌对抗菌药物的耐药性日益增加。世卫组织主管抗微生物耐药性的助理总干事巴尔希（HananBalkhy）称：“在细菌耐药性大流行的阴影下，真菌感染正在增加，并且对治疗的耐药性慢慢的升高，成为全世界的公共卫生问题。”线万死亡。

  临床可以在微生物实验室抗真菌药敏试验（AFST）的指导下尽早精准使用抗真菌药物，可以明显降低真菌感染的死亡率。

  常见菌种整体来说对棘白菌素类药物耐药菌株仍然少见。近年来，白念珠菌、滑念珠菌对氟康唑和伏立康唑的敏感性出现轻微下滑，但敏感性依然保持在90%左右。而热带念珠菌对氟康唑、伏立康唑的敏感性从94.3%分别下降至51.9%和43.0%，耐药率从5.7%分别上升至34.6%和32.0%，需引起国内临床的重视。[2]

  如何在较少的药物选择中优化抗真菌药物的治疗是临床医生最为关注的问题，而真菌的体外药敏试验是解决这样一些问题的第一步。真菌药敏试验可帮助临床医生确认菌株对抗真菌药物的耐药性、指导临床抗感染治疗方案的制定以及了解当地或全球疾病流行病学特征。

  然而，国内大多数临床实验室对于如何标准开展AFST存在一定的困惑。国内外⼴泛认可的真菌药物敏感试验标准化⽅法主要有美国临床实验室标准化协会（CLSI）发布的和欧洲抗⽣素药物敏感试验委员会（EUCAST）发布的最新真菌药物敏感试验参考⽅法，并以此为基础发展出商品化试剂，但仍存在报告时间过长操作繁琐，结果判读不准确等问题。

  分为酵母菌稀释法和丝状真菌稀释法，酵母菌稀释法的基本步骤和参数主要溯源于CLSIM27和CLSIM38等⽂件，针对不同菌属的真菌，药敏试验过程中接种物的浓度、培养的时间和结果判读的标准都有相应规定。除CLSI之外，EUCAST亦有对酵母菌和丝状真菌AFST的微量肉汤稀释的解释标准。

  尽管基于EUCAST和CLSI⽂件的真菌药物敏感试验参考⽅法相对准确、有利于实验室之间的结果⽐较和合作研究，但是上述⽅法操作繁琐，对人员要求比较高，因此很难在常规临床实验室开展。

  CLSI已经制定了酵母菌K-B药敏试验的标准化方案，推荐培养基是含有2％葡萄糖和0.5μg/ml浓度的亚甲基蓝染料（GMB）的水解酪蛋白（MH）琼脂。但丝状真菌的纸片扩散法解释标准尚未出台。纸片扩散法结果与微量肉汤稀释法获得的最低抑菌浓度(mic)结果之间有较好的一致性。

  E-test法是改良的纸片扩散法，可根据抑菌环大小可以读出相应药物的最小抑菌浓度。适用于念珠菌、隐球菌和产孢丝状真菌，该方法简单易操作，其结果与CLSI推荐的标准方法一致性较好。除此之外，梯度扩散法相对于K-B法的一个优势是能够肉眼直观获得MIC值。但结果解释具有一定的主观性。

  YeastOne真菌药敏板条采用比色法原理，用于念珠菌属、隐球菌属和曲霉菌属的体外药敏试验，采用手工操作测定包括唑类，多烯类，棘白菌素类，抗代谢类在内的抗真菌药物及最低抑菌浓度（MIC）。[3]干燥托盘保质期长，但不能解释唑类药物的拖尾生长现象，纯手工试验，操作繁琐，耗时时间长。

  ATBFungus3适用于念珠菌属和新型隐球菌属，可以检测5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑5种抗真菌药物。依靠肉眼判读结果，不能检测棘白菌素类药敏结果，且不能对曲霉菌菌属进行药敏试验。

  用一系列稀释的抗真菌药物处理后，并用荧光染料染色，用流式细胞仪测量真菌细胞的荧光信号。荧光信号的改变被认为是细胞活力的改变，即代表抗线]尽管流式细胞术与CLSI推荐的参考方法相比有很高的一致性，但此法操作较为繁琐，且需要具有高水平专业相关知识的技术人员，目前在临床中并未广泛开展。

  通常来说，一个菌株暴露在一定浓度的抗真菌药物中，通过MALDI-TOF质谱做多元化的分析，与不使用药物的药物相比，蛋白质组的任何变化都被解释为抗真菌药物诱导损伤的指标。[5]消除了当前CLSI方法中目测读数中存在的主观性，同时消除较长的周转时间（TAT），也减轻了念珠菌拖尾生长造成的判断困难。但目前质谱技术应用于真菌药敏检测数据库不够完善，缺乏稳定的检测标志物，阴性结果并不能完全证明其耐药性的缺失。总之，质谱技术之于真菌药敏检测应用具有广阔的前景，但亦存在一些局限性，要进一步完善。

  针对目前真菌药敏手工操作繁琐、肉眼结果判读难以标准化等问题，全自动真菌药敏试验解决方方案用独家专利荧光显色技术，微流控盘式设计以及自动实时动态检测抗菌药物作用后病原菌的增殖情况。全自动微生物药敏分析方法可大幅度的降低实验人员手工操作步骤。