【云飞杂记】细菌传之萃取

　　香水不单单是一种萃取物，它表达一种抽象的存在。 对我而言，香水是一个谜。——乔治·阿玛尼

　　云飞：简单说就是霉菌汁产量低，青霉素浓度低且不稳定。由于拿不到充足的浓缩品，更糟糕的是浓缩品在培养皿中的抗菌效果也时灵，时不灵，弗莱明对青霉素是啥东西判断不清，以至于不进行动物抗菌实验就戛然而止。他已经认识到青霉素是一种有机物，也许是霉菌分泌的是一种酶，谁知道呢？谜一样的存在。

　　希特利提高霉菌汁产量后，继续分离霉菌汁中的活性物质。弗莱明曾经尝试分离霉菌汁中的活性成分。利用有机物溶于有机溶剂的原理，将霉菌汁溶于中，当快速蒸发后，就能够得到浓缩的青霉素，但这一方法以失败告终，也许溶于的青霉素微乎其微吧，谁知道呢？

　　云飞：蒸馏和萃取都是分离混合物的技术，蒸馏利用混合物中各组成成分沸点不同，萃取则利用溶解度不同。

　　单纯的蒸馏不添加另外的溶剂，来保证不会引入新的杂质。在古希腊时代，亚里士多德曾经写到：“通过蒸馏，先使水变成蒸汽继而使之变成液体状，可使海水变成可饮用水。”白酒就是蒸馏酒，用蒸馏的方法去除杂质，提高酒精度数。扯远了，马上回来。

　　后来，一位化学家尝试改进分离技术。首先将霉菌汁倒入“分液漏斗”中。“分液漏斗”看起来像倒置的梨，漏斗底部有个旋塞阀，旋塞阀下面连接一个烧瓶。液体在分液漏斗中因密度不同而分层，较重的“含水层”位于底部，而“有机层”位于顶部。用力摇动分液漏斗，打开旋塞阀，让底部的“含水层”流出。通过每次在溶液中加入少许酸性，将青霉素转化为酸的形式，更好地溶于中。这位化学家的分离技术比弗莱明高明。然而，将浓缩液体中的蒸发掉以获得高浓度的青霉素时，残留的霉菌汁中没有留下任何弗莱明发现的抗菌物质，难道青霉素也随之蒸发了吗，谁知道呢？

　　希特利开始实验。如果青霉素随蒸发了，那么就把青霉素留在水中吧。接下来的操作，后来被他称为“简单得可笑”。首先加入酸性溶液，使青霉素转化为酸，溶于，进行萃取；然后加入碱水，发生酸碱反应，使青霉素转化为盐，溶于水，再进行萃取。

　　1940年3月19日，他按照此方法操作：用降落伞绸过滤霉菌汁，以去除固体颗粒，然后将过滤后的霉菌汁与酸性混合，使液体分层后进行分离，此时霉菌汁中的青霉素溶于。此后，将和青霉素的混合液与溶于水的碱性盐进行混合，然后再次分离。这一次，青霉素处于“含水层”。希特利获得了青霉素盐与水的混合溶液，其抗菌活性很稳定，在室温下能保持至少11天。“高纯度实验用量的青霉素萃取方法”由此产生。现在看来，这一说法有些浮夸，因为在弗莱明的霉菌汁中，青霉素的含量仅为百万分之一，而希特利的第一批萃取液中的青霉素含量也不超过万分之二。虽然纯度也不高，但提高了200倍。

　　云飞：嗯，一贴是使滤纸润湿，紧贴漏斗内壁，不残留气泡。防止气泡减慢过滤速度。二低是滤纸边缘略低于漏斗边缘。液面低于滤纸边缘。防止液体过滤不净。三靠是倾倒时烧杯杯口要紧靠玻璃棒上。玻璃棒下端抵靠在三层滤纸处。漏斗下端长的那侧管口紧靠烧杯内壁。防止滤纸破损，滤液飞溅。

　　云飞：嗯，将圆形滤纸两次对折，成为1／4圆形，然后一边一层，另外一边三层从中间拉开成锥形，放入漏斗。

　　钱恩早已准备好用新的青霉素萃取液做实验了。一拿到提纯后的青霉素，他便指导实施动物测试，将仅有的80毫克青霉素萃取液全部注射到两只老鼠的腹部。随着更多实验的完成，钱恩发现青霉素可以穿过玻璃纸的筛孔，蛋白质由于尺寸较大而没办法做到这一点。而且青霉素不可能会引起实验老鼠的免疫反应。青霉素不可能是蛋白！如果青霉素是一种蛋白，老鼠会表现出免疫反应：有极大几率会出现红肿或者炎症反应，但是它们并没有。实验老鼠在被注射青霉素的同时被注射了盐水，但这没有一点影响，因此青霉素绝非任何一种蛋白。令人惊喜的是，实验老鼠对青霉素几乎完全能适应，这说明青霉素很安全。更有意思的是，在实验老鼠尿液中的青霉素萃取液呈棕色，几乎和注射时的颜色一样，同时它仍有着非常强的杀菌性。理想的抗生素只杀死细菌，而不损害宿主细胞。他意识到青霉素有可能就是理想的抗生素。钱恩发现青霉素的分子式不但不复杂，而且相对简单。尽管如此，正如钱恩所说：“我们得知这种简单的结构是造成它的不稳定性的原因，这一点很有意思。显然，我们研究的对象是一种化学性质非同寻常的物质。”

　　邓恩病理学院团队即将分离出一种能够杀死病原体，但不会伤害宿主的物质，这一消息引起了医学界的高度关注。弗洛里将青霉素研究列为邓恩病理学院首要研究项目。1940年5月25日上午11点，弗洛里让8只实验老鼠感染了化脓性链球菌。该病原体可引发脓毒性咽喉炎、脓疱病、丹毒等疾病。中午，研究人员给两只实验老鼠注射了10毫克青霉素，给另外两只注射了5毫克青霉素。接下来的注射时间分别为下午4点15分、晚上6点20分和晚上10点。在实验室值最后一班的是希特利。希特利的实验笔记显示，在午夜之前，“一只老鼠站起来挣扎了几分钟，然后倒下，抽搐了一两下就死了。”5月26日凌晨4点，对照组四只实验老鼠全部死亡。而实验组四只接受青霉素治疗的实验老鼠全部活了下来。希特利放下实验记录，解脱、欢乐、幸福已充溢着他的全身。希特利离开实验室，迎着天边的第一道曙光，在空空荡荡的街道上骑着自行车，仿佛飘在云中。那个凌晨，他见证了即将改变世界的奇迹。

　　云飞：嗯，中国战场正在进行枣宜会战，第5战区部队在湖北省枣阳、宜昌地区对日军华中派遣军第11军进行防御战。5月1日，15万日军向襄河东岸第五战区部队发动大规模进攻。张自忠告谕五十九军各师、团主官：“只要敌来犯，兄即到河东与弟等共同去牺牲。愿与诸弟共勉之。”在以后的几天里，日军沿襄河东岸迅速向北推进，战局日趋恶化。为扭转战局，援救友军，张自忠决定东渡襄河，赴第一线督战。行前，张自忠写信说：“到河东后，设若与179D、38D取不上联络，即带马之3个团，奔着我们最终之目标（死）往北迈进。无论作好作坏，一定求良心得到安慰。以后公私，均得请我弟负责。”这分明是一封绝命书，忠义之志、壮烈之气跃然纸上。5月16日，张自忠将军亲率特务营至宜昌南瓜店附近截击日军，因发报密码被日军破译，深陷重围，张自忠力战不退，身中7弹，壮烈殉国，时年49岁，遂追晋陆军二级上将，成为上将战死第一人。噩耗传出，举国震悼，5月28日国葬于重庆北碚。延安各界也举行了隆重的追悼大会，、朱德、周恩来分别为张自忠将军题写了“尽忠报国”、“取义成仁”、“为国捐躯”的挽词。

　　欧洲战场也处于白热化阶段。5月26日晚18时57分，英国海军部下令开始执行“发电机行动”，此时形势比制定计划时更险恶，原准备使用的法国三个港口只有敦刻尔克可通过，布伦和加莱分别于23日和27日被德军占领。30万英法联军唯一的生路，就是敦刻尔克及其附近40公里海岸线日晚，即“发电机行动”的第一个晚上，在海军努力下，首批1312人，主要是后勤部队，顺利离开敦刻尔克回到英国。撤退行动一开始，就不可能再有机密可言，加之形势紧急，英国海军部开始在沿海和泰晤士河沿岸征用船只，甚至通过广播呼吁所有拥有船只的人前往敦刻尔克，这些船主非常明白撤出远征军对于英国意味着什么，所以积极做出响应海军部的呼吁，驳船、拖船、货船、客轮、渔船、汽艇乃至私人游艇，都纷纷出海，驶往敦刻尔克。先后有693艘英国船只和168艘法国、荷兰和比利时船只加入救援行列。

　　5月31日，英国远征军司令戈特奉命回国，他将指挥权移交给第1军军长亚历山大，亚历山大刚在敦刻尔克郊外焚毁了自己的座车，他是骑着自行车赶来接受指挥权的。在险恶形势下，素以沉着冷静著称的亚历山大越发表现临危不惧，在海滩上安了帆布躺椅，神态自若地坐在上面，平静地注视着部队秩序井然地登船，或是边啃着苹果，边在海滩漫步，毫不在乎空中飞机呼啸，地面炮火纷飞，他的这种镇定泰然的气势极大影响了部队情绪，有一名军官就站在海滩上精心地修着胡子，身边的勤务兵还为他拿着镜子；还有一个士兵竟然坐在船尾悠然垂钓，部队洋溢着对德军轰炸毫不在乎的蔑视。而那些坚守在阵地上的部队，则在坚持战斗，一些奉命后撤登船的部队也一边还击一边后撤，一直战斗到登船那一时刻。撤退从1940年5月26日开始做，至同年6月4日结束，共历时9天。此次撤军共有338226人从敦刻尔克撤到英国，其中英军约21.5万人，法军约9万人，比利时军约3.3万人，为盟军日后的反攻保存了大量的有生力量，创造了二战史上的一个奇迹。

　　在四年后的诺曼底登陆日，即1944年6月6日，他们将重返法国。当他们解放法国的时候，他们的医生和野战医院使用的最重要和最有效的药物将会是挽救了邓恩病理学院这四只老鼠的青霉素。扯远了，马上回来。

　　5月25日实验的成功不但激励了弗洛里，也鼓舞了邓恩病理学院团队的每一位科学家。一种很有前景且可行的解决方案是与英国的制药企业组织合作。英国帝国化学工业集团类似法本公司，是多家竞争企业，包括诺贝尔炸药和英国染料公司合并的公司，从1926年至今是是世界最大的化工品生产商之一。但与德国公司不同的是，它对药物不感兴趣。几家小型化学制造企业如肯博尔、毕肖普、康帕尼对青霉素有一定的兴趣，并于1940年3月在英国皇家学会主席戴尔的陪同下参观了邓恩病理学院，但这几家公司的实力无法承担这项研究。最有希望投资的是英国技术最先进的制药公司——伯勒斯·韦尔科姆公司。此公司由两位毕业于费城药剂学院的美国侨民于1880年创立。16年后，这两位有远见的美国人创立了英国首家生物制品研究机构，并根据科赫的抗白喉血清，研制出自己的版本。1940年6月，伯勒斯·韦尔科姆公司的两位化学家在参观邓恩病理学院时，弗洛里向他们建议双方一同攻克青霉素的生产和提纯难题，但他们礼貌地拒绝了。

　　德军没有轰炸牛津，弗洛里继续孤军奋战。他招兵买马，带领邓恩病理学院团队在三个不同方向齐头并进。希特利等人致力于提高青霉素菌汁的产量，提取更多活性成分；钱恩等人负责确定青霉素的结构，同时研究更好的分离提纯技术；生物学家和药理学家小组负责动物实验，并开始设计新的方案，准备将青霉素用于临床实验。弗洛里认为到了将实验成果公之于众的时候了。《作为一种化学治疗药物的青霉素》发表在1940年8月24日出版的《柳叶刀》上，作者为钱恩、弗洛里、加德纳、希特利、詹宁斯、奥尔尤因和桑德斯。由于钱恩和希特利之间关于著作贡献的争议，弗洛里迟迟未提交作者顺序表。在经历了几次对论文署名顺序的激烈争论后，弗洛里决定按姓名字母顺序排序。论文的首行这样写道：“近些年，人们对化学治疗效果的关注几乎完全集中在磺胺类药物及其衍生物上，然而我们还应当关注其他的可能性……”接下来的两页就详细的介绍了这种可能性，包括邓恩病理学院自3月开始实施的5项关键研究的结论。在这5项研究中，75只老鼠感染了葡萄球菌、链球菌、梭状芽孢杆菌等各种病原体：“在过去的一年中，为了获得大量青霉素，快速测定其抗菌能力，我们设计了多种方法。我们从培养基中获得了一种易溶于水的棕色粉末。它的溶液可在相当长的时间内保持稳定性，虽然它并不是一种纯净的物质，但它的抗菌活性非常强……”在弗莱明题为《论青霉菌培养物的抗菌作用》的论文发表11年零5个月后，人们终于了解到，“实验结果清楚地表明，青霉素在生物体内的活性至少可以抗击三种体外微生物。”

　　1941年1月，希特利的青霉素工厂已经制造出足够用于人体实验的青霉素，原先的产量只够用于体重为20克左右的老鼠，现在的产量能够适用于体重为150磅的人。做人体实验的目的是确认青霉素是否对身体有害，以及其抗菌性在人体内是否同样有效。毕竟，生物学家和病理学家已经发现几十种对人体健康细胞和病原体有着同样的杀伤力，因而不能用于人体治疗的抗菌化合物。弗洛里和他招募的拉德克利夫医院临床医生威茨负责甄选实验对象。是选择来自牛津大学的志愿者还是选濒临死亡的病人？他们决定选择后者。1月17日，已经处于癌症晚期，预估寿命只有一个月的拉德克利夫医院的患者埃克斯志愿接受100毫克的青霉素注射治疗。研究人员认为，鉴于此前在几十只老鼠身上做了实验，均未发现青霉素有副作用，该药用于人体也应该是安全的。但事实并非如此。刚刚完成注射，埃克斯便立刻发高烧并伴有癫痫发作。

　　云飞：纯青霉素是良性的。钱恩等人很快找到了原因，并解决了问题。萃取过程中的杂质导致高烧。用于解析青霉素结构的分离技术，一样能用于提纯青霉素，并剔除在提纯过程中混入的有毒物质。

　　注射第二轮青霉素后，埃克斯既没有发高烧也没有发抖。实验证实了青霉素的安全性，但这并不代表它就有治疗价值。下一阶段的测试，邓恩病理学院团队需要将青霉素实验从癌症患者身上转移到细菌感染者身上。1940年9月，牛津警察亚历山大在他的玫瑰园里划伤了脸。花园土壤中都会存在的细菌开始大量繁殖并在伤者体内积聚毒素。10月，亚历山大住进拉德克利夫医院接受专业的治疗。尽管拉德克利夫医院为其使用了磺胺类药物，但感染仍然扩散到亚历山大的肺部。到次年2月初，希特利见到他后，在日记上写道，这位警察“浑身上下都在流脓”。1941年2月12日，亚历山大接受了200毫克青霉素静脉注射治疗，后续每3个小时注射100毫克。他的医生后来才知道，当时用的青霉素的纯度仍然低于5%。一天后，连续8次的注射产生了奇迹般的疗效。亚历山大的烧退了，他的身体已不再排脓，脸上的肿也消了，他可以进食了。临床实验面临的问题是需要足够多的青霉素以维持疗效，希特利的机器连续工作几天才能生产出亚历山大一小时的用药量。通过老鼠实验，邓恩病理学院团队知道青霉素能够最终靠肾脏快速排出体外，并仍就保持其抗菌性能。于是，医生收集亚历山大排出的尿液，然后用自行车将尿液从拉德克利夫医院送到1.5英里外的邓恩病理学院实验室，以提取更多的珍贵的青霉素，再次使用。亚历山大并非需要青霉素的唯一病人。另一位年仅5岁的男孩儿琼斯，在臀部手术后，细菌感染，生命危在旦夕，也在接受类似的治疗。2月底，包括回收后重复利用的青霉素在内，所有的青霉素都用完了。琼斯得救了，而亚历山大于1941年3月15日去世。也就是说，当药量足够多的时候，青霉素就会发挥作用。

　　云飞：阿玛尼顺从家人意愿，进入米兰大学医学院。由于晕血，他在医学院学习两年后中断了学业。也许，正是因为医学基础教育，才让时尚大师对香水有自己独特的理解。

　　弗洛里估计下一轮临床实验所需的青霉素用量为一千克，没有实验室有能力制造这么多的青霉素，英联邦没有企业做，法国被占领，德国、日本和意大利都是敌对国，只有一个国家可以考虑。

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