发布日期： 2024-06-08 14:33:16 来源：HPLC法检测
Cancer Cell最新综述：新辅助免疫检查点阻断疗法——推动癌症免疫疗法的机遇
随着新辅助ICB及其与靶向激酶抑制剂、化疗、其他免疫疗法和实验性药物的组合的科学见解和临床益处的激增，这一转化研究领域仍然只是触及了可能性的表面。
在治疗癌症患者的新方法中，很少有像新辅助免疫检查点阻断疗法（neoadjuvant immune checkpoint blockade）那样迅速起效。癌症新辅助治疗是在对治疗无效的患者实施治愈性手术之前进行的，传统新辅助化疗和放疗的最大的目的是缩小肿瘤体积，提高手术切除率。然而，最新科学证据说明新辅助免疫疗法能够在一定程度上促进肿瘤特异性 T 细胞克隆，并对其进行转录修饰，从而增强瘤内和全身的抗肿瘤免疫力。它还提供了一个独特的“机会窗口”，通过研究免疫检查点阻断疗法（immune checkpoint blockade, ICB）反应和耐药机制并确定新的耐药生物标志物，将有利于完善长期临床结果预测和开发新的、更高效的 ICB 联合疗法。本文中，我们将探讨相关领域临床和科学知识的进展，并介绍与新辅助免疫治疗相关的一些重要的新原则。
新辅助免疫检查点阻断疗法正在不同癌症类型中进行临床试验，过去两年已有两种疗法获得了美国食品及药物管理局（FDA）的批准。新辅助癌症疗法是在对治疗无效的患者进行手术之前所实施的策略，新辅助免疫疗法除了能提高手术切除原发肿瘤的可能性外，还能进一步增加治疗效果，其能进一步利用原发肿瘤作为免疫系统识别的抗原来源，从而促使免疫系统识别肿瘤。除了增强原发肿瘤的手术切除能力外，新辅助免疫疗法进一步利用原发肿瘤作为免疫系统识别的抗原源，诱导或增强全身抗肿瘤免疫，以靶向和消除可能会成为术后复发的远端微小转移灶。虽然新辅助免疫疗法，如白细胞介素-2、癌症疫苗和抗CTLA-4等已在过去几十年的小规模试验中进行了试验，但随着PD-1通路阻断疗法的出现，无论是单独应用还是联合治疗，都加速了该领域的发展（图1）。从第一篇发表的关于非小细胞肺癌（NSCLC）新辅助抗PD-1单药治疗的报道到FDA首次批准新辅助抗PD-1/化疗联合治疗三阴性乳腺癌（TNBC）只过去了三年。
入组新辅助免疫检查点阻断临床试验的患者通常对其他全身性癌症疗法是初治的，并且具有被外科专家觉得可能可切除以治愈的癌症，但具有与复发高风险相关的临床病理学特征。根据癌症类型，新辅助治疗期可以在约3至24周的范围内，随后进行外科手术，该外科手术可以是最初计划的手术，或者根据肿瘤消退的临床/放射学证据进行定制。在手术标本中确定病理学反应。手术后，患者可进入观察期，接受标准护理或实验性辅助疗法，或接受针对其病理反应程度定制的辅助疗法。在新辅助ICB之前和之后收集的血液和组织用于支持生物标志物发现的多组学相关研究。化疗、化疗；ICB，免疫检查点阻断；RT，放射治疗；TKI，酪氨酸激酶抑制剂。
在某些特定的肿瘤类型中，使用ICB方案可以在相当一部分患者中实现病理层面上的完全缓解（pCR），即没有残留肿瘤细胞的组织学证据。因此，如果ICB导致肿瘤特异性T细胞的系统激活，并且切除组织中的病理反应反映了对外周微转移疾病的系统免疫反应，那就能预期病理反应与生存结果之间有相关性。的确，在TNBC和NSCLC的两个FDA批准研究中观察到了pCR和生存期（EFS，治疗开始后无疾病进展或死亡）的改善，这可能支持了新辅助ICB的假定免疫机制，并验证了病理反应作为长期临床预后的早期替代终点。这些发现还表明，病理反应不良可能需要额外的辅助（术后）治疗。
新辅助ICB除了能获得临床益处外，这种治疗方法还能为ICB反应和耐药机制的详细相关免疫学分析提供丰富的资源。首次，大量的活体肿瘤组织（有时还包括肿瘤引流淋巴结和周围正常组织）可用于对病理响应者与非响应者作比较分析。特别是，高维和超高维的蛋白质组学、转录组学、表观遗传学以及BCR和TCR重排分析平台可以对肿瘤治疗中的每一种细胞类型进行单细胞分析。这一些平台包括高维流式细胞术和单细胞RNA测序、ATAC测序和TCR测序。除了T细胞、B细胞和髓系细胞外，还能对基质细胞做多元化的分析，生成包含大量信息的公开可用数据库。最后，对完整肿瘤切片进行高维空间蛋白质组学和转录组学分析也提供了额外的信息。解析和挖掘这些丰富的数据集需要复杂的计算分析平台。除了基础研究发现外，预计这些科学努力将有利于指导新辅助免疫疗法组合的持续改进，造福患者。
新辅助ICB是临床研究中的一个多样而强大的领域，在数十种癌症中有数百项正在进行或计划中的临床试验。本文将着重关注其在一些癌症类型中的临床进展，如NSCLC、TNBC以及皮肤和胃肠恶性肿瘤，这些进展具有广泛的意义，可以轻松又有效地将这种治疗方法应用于其他癌症类型。我们还将探讨在新辅助治疗框架内科学地应用多组学研究，以更好地理解驱动ICB响应和耐受的免疫学机制。
在过去的10年里，晚期NSCLC的治疗方法发生了巨大变化，自2010年以来，已经批准了25种以上的新药物，主要是靶向治疗和免疫检查点抑制剂（ICB）。然而，在2020年批准用于EGFR突变的NSCLC的辅助治疗-奥西美替尼之前，对于可手术切除的肺癌的全身治疗已经有近15年的时间就没有取得任何进展。NSCLC的手术后预后是所有常见癌症中最差的，仅有50%的II期（原发肿瘤≥4厘米和/或涉及最近的淋巴结）或IIIA期（大肿瘤和/或涉及更远的淋巴结）患者在接受了手术后预计能够存活五年。与单纯手术相比，辅助顺铂为基础的化疗在五年内能够给大家提供约5%的总体生存率（OS）优势；然而，这种有限的益处限制了其在临床中的常规使用。PD-1通路阻断抗体，无论是作为单药治疗还是与化疗和/或不同的免疫检查点抑制剂（抗CTLA-4）联合使用，已成为大多数无法手术切除且缺乏可靶向驱动基因的晚期NSCLC的标准治疗。此外，对于无法手术切除的III期疾病，在放化疗后使用抗PD-L1（达伐单抗）疗法，临床上称为“巩固治疗”，能大大的提升长期生存率。来自多个3期试验的五年随访根据结果得出，约有10%的晚期NSCLC患者在初始系统治疗中应用抗PD-(L)1后能获得长期无进展生存（PFS），即有效治愈。
对于可切除的肺癌，新辅助化疗与辅助化疗相比，益处同样有限，但在耐受性、剂量强度和通过病理评估手术标本对治疗反应进行体内评估方面具有潜在优势。第一项报道的任何癌症类型的新辅助PD-1通路阻断临床试验是针对可切除的NSCLC。21名患者在临床I期B-IIIA期NSCLC手术前约4周接受尼伐单抗治疗，不强制要求辅助治疗。治疗耐受性良好，除一名患者外，所有患者均接受了完全手术切除。尽管治疗时间短暂，但45%接受切除的患者在手术标本中具有原发肿瘤的主要病理响应（MPR，切除标本中残留活性肿瘤≤10%）。深入转化分析显示，肿瘤和外周之间的T细胞克隆迅速膨大，包括在具有病理完全缓解（pCR）的患者中的突变相关新抗原（MANA）特异性克隆。事实上，这些克隆于4周内在血液中的迅速扩张和收缩类似于对病毒感染的急性反应。这些发现与新辅助ICB可能在肿瘤任旧存在的情况下激活全身抗肿瘤免疫的假设一致。有必要注意一下的是，尽管术前肿瘤成像展现出最小的放射学反应甚至是出现了明显的肿瘤生长，但在一些患者中观察到了显著的病理学反应。这揭示了随后在其他癌症类型中的新辅助ICB研究中再现的重要主题，即ICB诱导的肿瘤组织回归可能超过了放射学回归。这项小型试验的五年随访结果为，具有MPR的患者中没发生活动性癌症或与癌症相关的死亡案例，因此令人鼓舞。
在很多已经被报道的2期临床试验中，有几项关键研究探索评估了新辅助抗PD-1联合化疗或抗CTLA-4的治疗方案效果。在NADIM和NADIM-2试验中，可切除的III期非小细胞肺癌患者接受标准新辅助卡铂-紫杉醇化疗，同时选择性地接受尼伐单抗辅助治疗，持续6-12个月。单臂试验NADIM纳入了46名患者，结果为出意向治疗（ITT）人群中有57%的显著pCR率。36个月的总生存率为82%。NADIM-2试验随机将患者分为接受9周新辅助化疗与尼伐单抗或仅接受化疗的两组，随后再接受6个月的辅助尼伐单抗治疗。pCR终点从仅化疗组的7%提高到化疗免疫治疗组的37%，而关键的OS终点从24个月的63%提高到85%（风险比0.40，95%置信区间0.17-0.93；p=0.034）。同时，两项临床试验结果显示，当新辅助抗PD-1与抗CTLA-4联合使用时，其可能会增强疗效，报道的pCR率为33-38%（而仅有新辅助尼伐单抗治疗组为10%），但其有增加毒性的风险。最近，NEOSTAR平台试验报道了将新辅助尼伐单抗和伊匹单抗（抗CTLA-4）与化疗联合使用的结果。当在没有肿瘤EGFR或ALK突变的患者中添加伊匹单抗到新辅助尼伐单抗加化疗方案中时，MPR率提高到63%（而新辅助尼伐单抗加化疗方案的MPR率为41%），并且效应记忆CD8+ T细胞、B细胞和髓系细胞以及三级淋巴结构（TLS）的标志物也有所增加。
在此基础上，CheckMate 816随机性3期临床试验纳入了358例临床I期到IIIA期非小细胞肺癌患者，他们在进行明确的手术切除之前接受了约12周的新辅助化疗±尼伐单抗。无需辅助治疗。该研究的共同主要终点是pCR和EFS。在新辅助化疗方案中，尼伐单抗加化疗组有更多患者完成了原定计划的新辅助治疗过程（94% vs. 85%），并进行了明确的手术切除（83% vs. 75%）。添加尼伐单抗到新辅助化疗中没有增加治疗相关毒性或手术并发症，并且患者在化疗免疫治疗后有必要进行更少的广泛手术。ITT人群中的pCR率明显地增加，从仅化疗组的2.2%增加到化疗免疫治疗组的24%（比值比13.94，99%置信区间3.49-55.75；p0.0001）。添加尼伐单抗到新辅助化疗中显著改善了EFS的终点，其延长了近一年的时间（从中位数20.8个月增加到31.6个月，风险比0.63，97.38%置信区间0.43-0.91；p=0.005）。这一些数据使新辅助尼伐单抗加化疗在2022年3月获得FDA批准，并在美国以外地区获得了后续批准。虽然在肿瘤PD-L1表达水平较高的患者中，新辅助化疗免疫治疗有改善EFS的趋势，但该研究对亚组比较的统计效力不足，因而迄今为止的批准并不考虑PD-L1表达。在这项试验中，肿瘤突变负荷（TMB）无法预测新辅助化疗免疫治疗的效益。
值得注意的是，在CheckMate 816中，接受新辅助化疗免疫治疗并达到肿瘤pCR的患者2年的EFS超过90%，而未达到pCR的患者约为50%（风险比0.13，95%置信区间0.05-0.37）。这体现了pCR作为新辅助治疗生存益处的早期替代指标的潜力。该研究还在入组的23%的患者的术前期间使用了一种基于肿瘤信息的血液循环肿瘤DNA（ctDNA）检测的新方法。那些在手术前消除了ctDNA的患者趋向于改善EFS（风险比0.60，0.20-1.82）。最近，AEGEAN试验的初步结果被揭示。这是第一个评估新辅助化疗免疫治疗后辅助免疫治疗作用的3期临床试验，而CheckMate 816并未规定任何术后治疗。AEGEAN纳入的患者被随机分配接受12周的新辅助铂类化疗加达伐利珠单抗或安慰剂，随后进行手术，接着进行最多一年的辅助达伐利珠单抗或安慰剂。该研究的两个主要终点，pCR和EFS，在首次中期分析中均为阳性。达伐利珠单抗组的病理学CR率从对照组的4.3%增加到17.2%。在做出结论报告时的EFS风险比为0.68（0.53-0.88；p=0.003902），其有利于达伐利珠单抗组。有必要注意一下的是，尽管添加了为期一年的辅助抗PD-L1，但这些结果似乎并不比CheckMate 816的结果更好。一个需要警惕的点是，在AEGEAN试验报告时，只有约31%的患者对EFS进行了评估。新辅助尼伐单抗加化疗的批准以及关于辅助抗PD-(L)1的新结果，引发了对肺癌新辅助和围手术期（新辅助加辅助）临床试验的再度关注（表1）。预计将有几个更多的新辅助化疗免疫治疗后辅助免疫治疗为期一年的3期临床试验结果将在2024年被报道出来，而将辅助免疫治疗纳入的风险与益处的平衡将继续成为辩论的关键议题。
三阴性（雌激素受体、孕激素受体和HER2阴性）和HER2+乳腺癌是侵袭性肿瘤，临床预后不佳，其促进了针对局部晚期疾病的标准治疗新辅助化疗方案的发展。这种方法为新辅助免疫治疗的改善与提高奠定了基础。与其他癌症一样，新辅助乳腺癌治疗相比直接手术具有潜在优势，包括缩小肿瘤（潜在避免切除术并改善美容效果）、早期用系统性疗法治疗微转移疾病以及在治疗过程中评估肿瘤反应，以便在初始治疗无效时及时地替换其他药物。它还提供了关于长期临床预后（EFS、OS和无病生存）的相关信息，这反映于手术过程中存在的病理响应程度，其中pCR与长期临床预后的改善紧密关联。免疫疗法在乳腺癌中的发展大多分布在在TNBC上，因为其治疗靶点有限，更频繁地表现出免疫活性，并存在持续的临床需求。因此，新辅助免疫治疗策略自然适用于早期TNBC。在TNBC晚期抗PD-(L)1单药治疗的初步临床试验仅仅显示出极低的响应率（取决于先前治疗和肿瘤PD-L1表达情况，约为5-25%），因此临床研究方向迅速转变成在晚期和新辅助治疗中的化疗免疫疗法策略。
首次获得FDA批准作为所有癌症类型标准治疗的新辅助免疫治疗组合是用于早期TNBC。这项批准是基于KEYNOTE 522，一项随机的3期临床试验，招募了1174例未接受治疗的II-III期TNBC患者。共同的主要终点是pCR和EFS。患者被随机分配接受帕博利珠单抗（抗PD-1）与紫杉醇和卡铂联合治疗约12周，然后接受帕博利珠单抗与蒽环类化疗药物联合治疗约12周，随后进行有治愈意图的手术。术后，患者接受帕博利珠单抗或安慰剂单药治疗约27周，总治疗周期约为1年。新辅助治疗中帕博利珠单抗与化疗的pCR率分别为63%（95% CI 59.6-66.4）和56%（95% CI 50.6-60.6）。在中位随访39.1个月时，帕博利珠单抗或安慰剂与化疗的36个月EFS率分别为84.5%和76.8%（HR 0.63，95% CI 0.48-0.82；p0.001）。与转移性TNBC的ICB不同，在KEYNOTE 522中，无论PD-L1表达如何，都观察到了临床益处。因此，目前没有用于选择接受新辅助免疫治疗的TNBC患者的预测性生物标志物。基于这一些数据，新辅助化疗后帕博利珠单抗联合辅助帕博利珠单抗单药治疗高危早期TNBC于2021年7月26日获得FDA全面批准。KEYNOTE 522为进一步研究提供了多个机会，如下所述。
FDA批准的一项针对高危乳腺癌的12项随机临床试验进行的荟萃分析，其评估了术前或术后给予化疗方案的预后，结果显示pCR与患者的OS之间有强烈的关联（其中pCR代理终点和OS强烈相关），但在试验水平上并不存在这种关联（在试验终点上治疗效果对临床终点的影响是否被代理终点有效捕捉）。尽管监督管理的机构在乳腺癌相关研究的快速批准中支持pCR作为长期临床益处（即EFS和OS）的替代，但有必要注意一下的是，在KEYNOTE 522之前，只有HER2定向抗体帕珠单抗在新辅助治疗中获得了提前批准（于2013年）。这是基于NEOSPHERE试验，该试验根据结果得出将帕珠单抗加入新辅助曲妥珠单抗联合化疗与对照组相比，pCR显著改善，乳腺和总体（乳腺加腋窝）pCR率分别增加了16.8%和17.8%。五年的PFS和DFS率与pCR的改善相一致，但该试验的功效不足以明确评估这些终点，并且pCR与长期临床益处的关联仍然不确定。这种不确定性在FDA对早期TNBC新辅助化疗后帕博利珠单抗的批准过程中得到了体现，FDA并没有仅仅基于pCR的显著改善而授予快速批准，而是等待进一步临床数据的出现证明除了pCR改善外还存在非常明显的EFS益处，然后才授予全面批准。
除了作为特定新辅助治疗方案的预后标志物或临床益处的替代终点外，病理层面的响应性若能够指导术后切除治疗决策将具有巨大的价值。最直接的是，在手术中观察到的病理反应程度能为治疗的升级或降级提供机会，这在以往对TNBC和HER2+乳腺癌的常规治疗中已经评估过。对于TNBC的新辅助免疫治疗，对于达到pCR的患者可能不需要免疫治疗的辅助阶段。在KEYNOTE 522中，无论是不是在新辅助化疗中接受了帕博利珠单抗，达到pCR的患者的4年EFS率均为93-94%。此外，GeparNuevo试验表明，在新辅助durvalumab联合化疗中达到pCR且没有辅助阶段的患者的3年OS为100%。有必要注意一下的是，在这两项研究中，接受新辅助化疗和免疫治疗且手术后仍有残留疾病的患者的临床预后明显优于安慰剂组。有必要进行正式评估在新辅助化疗免疫治疗中达到pCR的患者中，接着来进行辅助免疫治疗与观察的试验。在标准新辅助化疗后仍有残留疾病的患者中接受辅助性卡培他滨治疗，或在有生殖系BRCA突变的情况下接受辅助性奥拉帕尼治疗（PARP抑制剂）。许多医生在帕博利珠单抗是治疗方案的一部分时也遵循这个范式，尽管没有具体数据来验证这个决策范式。
KEYNOTE 522方案使用了6个月的新辅助化疗，除了帕博利珠单抗外，还使用了4种不同的细胞毒性药物。重要的是，无论是不是同时使用免疫治疗，包括卡铂在内的标准新辅助化疗是否有益仍不清楚。几项临床试验已经证明，在不使用卡铂的标准新辅助化疗中加入抗PD-(L)1（阿特伊珠单抗、帕博利珠单抗或杜瓦卢单抗）能改善pCR。NeoTRIPaPDL1米开朗基罗试验测试了280名早期三阴性乳腺癌患者，比较了6个月的新辅助阿特伊珠单抗联合纳帕紫杉醇和卡铂与单独化疗，随后进行手术，接着进行辅助蒽环类化疗的效果。结果显示，无论肿瘤PD-L1表达如何，两组之间的pCR率均没有差异，这表明在新辅助治疗阶段包括蒽环类药物可能很重要。相反，单臂2期NeoPACT试验测试了约4个月的新辅助卡铂和多西他赛联合帕博利珠单抗，pCR率为60%，无需辅助帕博利珠单抗的2年无病生存率为88%。肿瘤中含有≥30%的间质肿瘤浸润淋巴细胞的患者pCR率较高，这表明在早期疾病中给予免疫治疗时，准确选择最大有可能从免疫治疗中获益的患者可能对减少化疗依赖性至关重要。
I-SPY2是一个高度创新的、自适应随机的2期新辅助平台试验，能同时评估多种研究药物与由标准蒽环类和紫杉烷类化疗组成的固定对照组的对比，时间持续24周。主要终点是总pCR率。如果在假设的300例亚型特异性3期试验中达到85%成功率的预定义阈值，那么所研究的治疗方法将被认为有效；如果缺乏疗效、无效或毒性，相关治疗可能会被强制终止。首个用于评估的ICB方案是为期12周的帕博利珠单抗与紫杉醇联合治疗，随后是12周的标准新辅助蒽环类化疗。相较于接受单独紫杉醇治疗的201名对照患者，69名患者（40例激素受体（HR）阳性乳腺癌和29例三阴性乳腺癌）接受了帕博利珠单抗加紫杉醇治疗，帕博利珠单抗在HR阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌中的预计pCR率分别为30%和60%，对照组分别为13%和22%。另一个评估为期12周的帕博利珠单抗与紫杉醇联合治疗，随后是12周的单独帕博利珠单抗的方案因缺乏疗效而被停止。I-SPY2还评估了奥拉帕尼与杜瓦卢单抗和紫杉醇联合多柔比星加环磷酰胺的方案，这两个方案在HR阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌中均被认为有效。I-SPY2中正在评估的其他新型辅助ICB方案包括帕博利珠单抗与SD-101（TLR9激动剂）联合治疗、塞米利珠单抗（抗PD-1）与紫杉醇联合治疗，以及塞米利珠单抗与REGN376（抗LAG-3）联合治疗。在I-SPY2的五个不同的抗PD-(L)1方案中进行的假设生成的生物标志物分析发现，无论肿瘤HR状态如何，肿瘤免疫特征均主要由趋化因子/细胞因子组成，其与所有基于抗PD-(L)1的方案中的pCR一致性相关。这一发现反映了PD-L1阳性肿瘤细胞和PD-1阳性免疫细胞的共定位。这种平台试验设计能够迅速评估有前景的新药的临床活性，并探索潜在的可预测性的生物标志物，相关研究目前正在扩展到其他癌症类型。
作为所有人类癌症中最具免疫原性的一种，黑色素瘤长期以来一直是免疫疗法（包括ICB）早期研究的类型之一。它也是最早用于测试新辅助抗PD-1治疗的癌症类型之一。与其他癌症中新辅助ICB试验不同，黑色素瘤的试验侧重于治疗局部区域III期转移性肿瘤和微转移IV期肿瘤，而不是原发肿瘤。这是因为局部原发性I-II期皮肤黑色素瘤通常只有几毫米或更小，通常能够最终靠手术治愈，并且通常在转移出现之前就已经切除。由于无法手术切除的晚期黑色素瘤对抗PD-1单药治疗具有较高的客观缓解率（约40-50%的完全缓解和部分缓解），预计新辅助抗PD-1的病理缓解率将非常有可能超过这一水平。令人惊讶的是，2018-2019年发表的四项临床试验结果共同显示，新辅助抗PD-1单药治疗的MPR率低于预期（25-30%）；通过将抗CTLA-4添加到新辅助治疗方案中能大大的提升病理缓解率，这种策略能促使具有至少50%病理缓解（“病理部分缓解”，pPR）的患者长期无复发生存（RFS，手术后复发或死亡时间）。在可切除的III-IV期黑色素瘤新辅助治疗发展的同时，两种不同的抗PD-1药物（尼伐替尔回和帕博利珠单抗）在FDA获得了作为切除后辅助治疗的批准，其可用于完全切除的III-IV期黑色素瘤患者，随后基于大型随机试验的根据结果得出该治疗策略显著延长了复发时间。这为进一步开发黑色素瘤新辅助ICB创造了新的基准，因为它将有利于ICB确立为可切除转移性黑色素瘤的有效治疗范式。临床前和早期临床数据表明，新辅助ICB可能比辅助ICB更有效，因为它可以在肿瘤任旧存在时产生更强大的全身抗肿瘤免疫。黑色素瘤成为首个直接测试这样的一个问题的癌症类型，并在SWOG S1801临床试验（ClinicalTrials.gov NCT03698019）中进行了测试。在这项临床试验中，313名可切除的III-IV期黑色素瘤患者被随机分配接受抗PD-1（帕博利珠单抗）术前和术后治疗，或仅术后治疗（标准辅助治疗）。所有患者总共接受了约一年的治疗。有必要注意一下的是，与仅接受辅助治疗的患者相比（72% vs 49%），接受新辅助/辅助治疗的患者的2年无病生存（EFS）期明显延长。另一项正在进行的NADINA（NCT04949113）临床试验通过比较新辅助抗PD-1（尼伐替尔回）+抗CTLA-4（伊匹单抗）术前治疗后手术和标准辅助治疗（如果残留活性肿瘤10%，则使用尼伐替尔回或BRAF/MEK抑制剂治疗BRAF突变型黑色素瘤），与立即手术和标准尼伐替尔辅助治疗来解决同样的问题。尽管新辅助免疫疗法目前在黑色素瘤中尚未获得FDA批准，但一些肿瘤学家基于SWOG S1801临床试验结果仍然认为这是一种新的且非常有潜力的标准治疗方法。事实上，2023年5月，新辅助/辅助帕博利珠单抗治疗III期黑色素瘤已经获得了澳大利亚药物效益咨询委员会的认可。
黑色素瘤研究人员是第一批召集正式利益相关者研讨会和国际合作小组的成员，致力于推进包括ICB在内的新辅助治疗。特别是，国际新辅助黑色素瘤联盟（INMC）关于调整新辅助ICB试验和相关科学研究的设计、实施和解释的早期共识建议影响了该领域。INMC提倡创新的手术方法，例如在开始新辅助ICB之前植入肿瘤标记物（如乳腺癌中的标准），以防肿瘤几乎完全消退导致手术定位困难；以及在经历实质性肿瘤消退的患者中进行不太广泛的手术。Reijers、Blank及其同事进一步扩展了这一想法，进行了非随机普拉多试验，其中99例III期黑色素瘤患者在新辅助治疗环境中接受nivolumab加ipilimumab治疗6周，随后对先前标记的代表性“索引淋巴结”进行活检以确定病理学响应情况。进一步的治疗根据索引淋巴结的病理学反应水平做调整，如果是pCR或MPR，则包括单独观察，如果是pPR，则进行完全淋巴结盆切除，或者如果有超过一半的肿瘤存活，则有必要进行完全淋巴结切除加标准辅助治疗。然而，在达到pCR/MPR或pPR的患者中发生几次复发表明一些患者可能治疗不足，并强调需要更加多信息的生物标志物来个性化新辅助/辅助治疗策略。
即将出现的用于黑素瘤的新辅助ICB方案包括新的治疗组合，例如抗PD-1（纳武单抗）加抗LAG-3（relatlimumab）、或抗PD-1（派姆单抗）加抗TIGIT（vibostolimumab）；靶向具有有利遗传特征的罕见黑色素瘤亚型，例如有很高TMB的促结缔组织增生性黑色素瘤；治疗高风险局部原发性IIB/C期疾病（ClinicalTrials.gov NCT 03757689），其佐剂抗PD-1（派姆单抗）最近被FDA批准。
新辅助ICB正在非黑色素瘤皮肤癌中测试，所述非黑色素瘤皮肤癌包括默克尔细胞癌（MCC）、皮肤鳞状细胞癌（cSCC）和基底细胞癌（BCC）。这些局部晚期或转移性非黑色素瘤皮肤癌发生在相对罕见和老年患者群体中，通常发生在头部和颈部，并且可能被患者忽视多年，导致具有挑战性的临床表现。这些皮肤癌往往有很高的体细胞TMB，因为它们通常是由长期暴露于紫外线（一种致癌物质）引起的。高TMB倾向于预测对ICB的敏感性，这确实是MCC和cSCC的情况。在MCC中，在晚期不可切除的治疗环境中施用ICB（纳武单抗、派姆单抗、阿维单抗）后的高肿瘤消退率和快速消退动力学转化为在短暂的新辅助抗PD-I（纳武单抗）单一疗法后的高pCR可能性。有必要注意一下的是，36例可手术切除的MCC患者中的47%在新辅助纳武单抗单一疗法仅约4周后经历了pCR。pCR患者术后2年的RFS明显高于无pCR患者（88.9% vs 52.2%）。同样，在晚期不可切除的cSCC中，抗PD-1单药治疗（cemiplimab）后的高肿瘤消退率转化为在新辅助治疗环境中治疗约12周的79例可手术切除疾病患者中的51% pCR率。与主要集中于治疗III-IV期疾病的黑色素瘤新辅助ICB经验不同，许多MCC或cSCC患者接受了局部晚期原发性肿瘤治疗，而其他患者则有区域淋巴结（III期）或远处转移（寡转移IV期）。在一些头颈部美容敏感部位肿瘤的患者中，对于临床病理学CR的患者，避免了可能毁容的手术。最后，对于可切除BCC的新辅助ICB，迄今为止的相关经验有限，这可能代表了临床非常感兴趣的领域（例如，ClinicalTrials.gov NCT04323202）。
新辅助ICB正在广泛的胃肠道癌症中来测试，根据肿瘤类型具有高度可变的疗效。生物标志物驱动的见解解释了这种变异性，揭示了ICB反应和耐药性的一般性原则。
ICB在以高新抗原负荷为特征的错配修复缺陷（MMRd）的癌症患者中具有非常明显的临床活性，并且其在围手术期环境中在该亚组中的使用是密集临床研究的领域。在非转移性癌症（8%）中鉴定出的MMRd的频率是晚期癌症（4%）中的大约两倍，代表美国每年约有40，000例I-III期癌症被诊断出来。MMRd在早期与转移性癌症中的富集可反映该疾病亚组中的有效免疫监视，表明非转移性MMRd肿瘤可能特别适合于ICB。此外，MMRd肿瘤通常不会受益于标准围手术期化疗方案，这强调了对新治疗方法的需求。最近在MMRd肿瘤中的前瞻性新辅助免疫疗法试验包括在MMRd结肠直肠癌（CRC）中的NICHE-1（NCT 03026140）、NICHE-2（EudraCT -1）和PICC（NCT 03926338）；GERCOR/NEONIPIGA（NCT 04006262）和INFINITY治疗MMRd胃食管癌；局部晚期dMMR直肠癌研究和肿瘤不确定性MMRd前瞻性队列，其他的还有几项回顾性队列研究。尽管这些研究在不一样的地区是采用不一样的ICB方案和肿瘤组织学进行的，但它们总体上显示所有队列的进展事件发生率较低，病理学缓解率较高，在迄今为止报告的最大研究中，约60%的患者实现了pCR。
迄今为止报道的非转移性MMRd癌症中新辅助免疫治疗的病理学应答率明显高于转移性背景中的病理学应答率；即使在非转移性肿瘤中，反应率也可能与肿瘤分期相关。例如，在INFINTY研究中，T2-T3疾病患者的pCR率为8/9%（8/9），T4疾病患者的pCR率为17%（1/6）。这可能反映了随着这些肿瘤的进展，遗传异质性和免疫抗性增加，并为考虑在MMRd肿瘤中尽早使用ICB提供了理由。MMRd CRC和MMRd胃癌的病理学缓解率相似，但在其他组织学类型中可能较低。在迄今为止唯一的肿瘤类型不确定性系列中，2/2例可能可切除的MMRd胰腺癌患者在ICB时发生疾病进展，有必要进行手术挽救。这类似于转移性情况，其中胰腺MMRd肿瘤似乎比其他MMRd肿瘤类型的反应性更低。因此，新辅助ICB在非转移性MMRd癌症中的临床益处可能不仅因癌症阶段而异，而且因肿瘤组织学而异。由于非转移性MMRd肿瘤具有取决于癌症分期和肿瘤组织学的独特手术风险，以及独特的监测挑战，因此新辅助ICB方法最终在大多数情况下要在每种肿瘤类型和分期内进行改进以优化患者结局。
在可切除的MMRd肿瘤中实现的异常pCR率为新的非手术器官保存方法铺平了道路。在Cercek及其同事的一项研究中，100%（12/12）接受抗PD-1（dostarlimab）治疗6个月的局部晚期MMRd直肠癌患者的放射学和内镜检查完全缓解，连续活检≥6个月无残留肿瘤证据。常规放化疗加手术干预，往往会导致终身肠道和膀胱功能障碍和不孕症，完全避免在这个队列。这些研究结果，虽然在一个小的队列中，为新辅助ICB奠定了基础，作为一种有效的方法，完全消除传统的程序，即使癌症被治愈，也可能对生活品质产生重大的终身影响。在一个单独的、真实世界的不适合手术的局部晚期或寡转移性CRC患者队列中，13/23（57%）达到了完全的放射学缓解，可能避免了手术的需要。在器官保存策略可以被宣布为MMRd患者的新护理标准之前，需要更大的多中心队列和更长期的随访，但现有数据表明，在许多情况下，单独的免疫治疗可以是早期MMRd CRC患者明确的肿瘤清除治疗策略。
在HCC中，新辅助ICB的可行性最近在三个独立的单机构研究中得到证实。这些初步研究证明了nivolumab加卡博替尼（多激酶抑制剂）、nivolumab与或不与伊匹单抗和cemiplimab的MPR率为20-33%，在病理应答者亚组中具有非常出色的存活率。虽然许多新辅助ICB研究的最大的目的不是改善肿瘤的可切除性，但新辅助纳武单抗加卡博替尼在HCC中的小型先导性研究的独特之处在于其纳入了传统切除标准之外的潜在可切除患者（例如具有主要血管受累或多灶性疾病的患者）及其使用具有阴性实质边缘的切除作为主要终点。最近报道了辅助阿特珠单抗加贝伐珠单抗（血管生成抑制剂）在切除或消融后改善了HCC患者的RFS，并且可能被采用作为复发高风险患者的护理标准（AACR 2023年年会，摘要CT 003）。然而，根据巴塞罗那临床肝癌（BCLC）指南，只有约20%的HCC患者具有可切除的肿瘤。新辅助免疫疗法在HCC中的初步成功能扩大并最终可优先考虑用于治愈意图范例的患者库（图2）。
图2：肝细胞癌中的新辅助疗法降级/可切除性策略。只有一部分（约20%）的HCC是可切除的，在接受潜在治愈性切除术的患者亚组中，70%或更多的患者最终会复发。新辅助和辅助免疫疗法治疗策略都能够给大家提供降低复发风险的可能性，然而新辅助免疫疗法还提供了测试疾病生物学以选择可能受益于切除术的患者的可能性，并且通过改变疾病生物学和降低疾病为局部晚期或不可切除的患者的分期来扩大可能考虑切除的人群。AFP：甲胎蛋白。
在胃食管癌中，其中抗PD-1疗法已在转移性和辅助环境中确立疗效，新辅助ICB是活跃的临床研究领域。FLOT-AIO德国胃癌组和瑞士SAKK组的随机2期DANTE研究比较了标准护理围手术期化疗（FLOT）与FLOT + atezolizumab。根据临床淋巴结分期和原发部位（胃食管交界处vs胃）以及MMR状态对本研究中的患者进行分类。中期结果显示，含atezolizumab组的病理学缓解率适度改善（49% vs 39%）。atezolizumab的益处似乎在具有高PD-L1表达（CPS10%）的肿瘤亚组中更明显，其中FLOT + atezolizumab的病理学缓解率为67%，而单独FLOT的病理学缓解率为39%。虽然这些初步结果要进一步确认，但它们表明肿瘤PD-L1表达可能是选择胃食管癌患者进行新辅助免疫治疗的有用生物标志物。
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种显著的免疫耐受性肿瘤，其中免疫疗法迄今未能在任何疾病背景中最终显示临床益处，并且OS仍然令人沮丧（5年存活9%）。在大多数癌症中，新辅助免疫疗法研究通常仅在晚期疾病环境中证明疗效后进行。然而，在胰腺癌中，新型免疫治疗剂早在晚期治疗环境中证明临床疗效之前就已在机会窗研究中部署，提供了关于潜在疗效和治疗反应机制的快速病理学见解。例如，最近启动的PIONEER-Panc 2期研究使用贝叶斯平台设计来在患有可切除、边缘可切除和局部晚期疾病的患者中同时评估一个或多个实验组相对于常见化疗对照组。这种创新药物开发框架在上述乳腺癌I-SPY 2平台试验中有先例。它反映了对PDAC新疗法的迫切需求，并为快速评估和发展可应用于肿瘤类型的新型疗法提供了蓝图。
由于能够在ICB前后获得大量的活组织和血液（图1、图3），新辅助ICB设置独特地定位于解决围绕治疗应答和耐药机制的基本问题，这对于晚期不可切除的癌症在常规条件下是不可能的。在每一项新辅助ICB试验的设计中，获取这些珍贵的生物标本必须是重中之重。肿瘤学家、外科医生、病理学家和实验室科学家之间的协调对于提供全面的血液和组织采集计划以产生用于准确分析的高质量组织和细胞样本至关重要，特别是对那些需要活细胞的样本。即使在手术时具有部分或完全病理学消退的肿瘤中，其可能具有有限的或没有可用于分析的活肿瘤细胞，剩余的肿瘤床仍旧能用作丰富的重要和相关的免疫学信息。在本节中，我们将讨论可以在新辅助ICB研究的生物标本上进行的免疫学研究，以定义反应的生物标志物，发现新的可操作的靶标和途径，并推进我们对ICB如何在肿瘤免疫微环境（TiME）中全身和局部影响细胞的基本理解。对这些研究，高维分析，如高参数流式细胞术、单细胞（sc）RNA序列和耦合的scTCRseq，空间基因组学和蛋白质组学正在改变我们理解ICB对TME的影响的能力。这些研究的转化影响提供了潜在的预测性生物标志物，以指导手术后辅助治疗，并发现免疫调节分子和细胞，其可当作ICB的辅助治疗靶向目前批准的抗体。
新辅助研究提供了在免疫检查点阻断（ICB）治疗之前、期间和之后获取血液和大量活组织的独特机会，这对于大多数不可切除的癌症来说是常规没办法实现的。在连续时间点获得的外周血可用于分离血浆、血清和外周血单核细胞（PBMC）。然后，这些样品可以在下游用于分析循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞因子和抗体（血清组学），以及使用流式细胞术和飞行时间细胞术（CyTOF）分析免疫细胞表面和细胞内蛋白质表达，以及使用T细胞受体（TCR）测序分析T细胞库。此外，治疗前肿瘤活检和切除的肿瘤、邻近的健康组织和肿瘤引流淋巴结能够准确的通过所需的下游分析以多种方式保存，包括快速冷冻、固定和石蜡包埋（FFPE）以及可行地冷冻保存的酶促消化的单细胞悬浮液。这些组织存档方法将允许RNA测序（RNAseq）、qRT-PCR、全外显子组或基因组DNA测序（WES、WGS）、TCR测序、免疫组织化学（IHC）、多光谱免疫荧光（mIF）、空间转录组学、功能性细胞测定和单细胞转录组学以及其他可能性。使用来自网站来创建所有图片。
在ICB的背景下，对TiME的最基本分析来自切除标本中残余存活肿瘤百分比的病理学评分。然而，对ICB后组织标本的免疫学特征进行更详细的分析有可能改善长期EFS/RFS/OS的预测。与大多数癌症类型的晚期转移背景类似，预测ICB反应的两种常规测试，肿瘤中的PD-Ll表达和TMB，迄今为止在新辅助ICB的背景中是不完美的生物标志物。对于NSCLC新辅助治疗试验，不同研究中这些参数与结局的相关性不同。在一项研究中，在新辅助抗PD-I（纳武单抗）后，TMB与残留肿瘤百分比之间有相关性，尽管可以生成TMB估计值的患者数量很少（n=11）。这11例患者的TMB与RFS或OS改善无关。此外，在本研究中，肿瘤PD-L1表达与病理学反应程度无关。相反，在Reuss等人的报告中，肺肿瘤PD-Ll表达而不是TMB预测了对新辅助抗PD-I（纳武单抗）加抗CTLA-4（伊匹单抗）的病理学应答，尽管该研究中可评估的患者数量也很小（n=6）。在一项规模稍大的研究中，对19例局部晚期胃癌患者的切除标本进行了评价，PD-L1和TMB均与新辅助抗PD-1（camrelizumab）联合阿帕替尼（VEGFR-2激酶抑制剂）和化疗的病理学应答相关。
虽然由切除时的残余肿瘤定义的病理学应答正成为长期临床益处的既定生物标志物，如上所述，但肿瘤切片的更复杂分析有机会加强完善临床决策以及理解对ICB的应答与抗性的机制。Cottrell等人已经提出了免疫相关病理反应标准（irPRC）来评价与新辅助ICB治疗相关的某些组织学特征。该方法不仅告知了在新辅助ICB期间发生的并且与病理学应答相关的肿瘤内免疫事件，而且揭示了病理学和放射学应答之间的动力学差异的大多数来自，即MPR肿瘤中的消退床被占据并且以几种TiME重塑特征为特征，包括新血管形成、来自肿瘤细胞死亡的胆固醇裂解和增殖性纤维化。这样的特征在常规射线照相扫描上可以表现为固体块。更详细的空间研究发现，新辅助ICB具有诱导多种炎性浸润的潜力，包括CD 8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、嗜中性粒细胞和浆细胞；它还可以上调某些免疫检查点途径，减少免疫抑制性M2巨噬细胞的数量，并在肿瘤床中产生有组织的TLS。这些作用能够最终靠新辅助ICB的类型或组合来调节。例如，如上所述，在NEOSTAR试验中治疗的可切除肺癌中，向新辅助化疗加PD-1阻断中添加伊匹单抗导致CD 8 + T细胞活化标志物的表达增加，并且与免疫抑制相关的标志物的表达减弱。这些参数中的一些可能与病理学应答与耐药性和/或长期临床结局相关。在比较具有或不具有抗PD-I的GM-CSF分泌型疫苗的胰腺癌新辅助ICB试验中，TiME中嗜中性粒细胞脱粒的增加与较差RFS相关。也有报道支持CD 4 + Tconv细胞在ICB应答中的作用至今未被充分认识。Li等人发现，ICB影响CD 4 + T细胞的趋化性，并可促进TLS的发展，TLS成为免疫调节的位点，而另一项研究表明，具有MPR的肿瘤具有更大的CD 4 + T细胞浸润。CD 4+滤泡辅助性T细胞对E.大肠杆菌和其他共生细菌是PD-I阻断的主要靶标，并且促进膀胱癌中新辅助ICB的临床功效，尽管这些发现可能是这种癌症类型所独有的，并且它们的体内相关性要进一步验证。
在新辅助ICB环境中，非造血细胞的作用也慢慢变得受到重视。例如，在新辅助抗PD-I（纳武单抗）疗法后消退的默克尔细胞癌中，使用地理块RNAseq鉴定了突出的基质成肌纤维细胞特征，这与肿瘤细胞消除后发生的组织重塑一致。虽然这里讨论的大多数相关研究都是在小患者队列中进行的，但它们激发了正在进行的试验中更大队列的随访研究。
将这些多组学分析提升到更高的水平，具有前所未有的分辨率的新兴空间转录组学技术有可能为支持对新辅助ICB的应答和抗性的直接细胞相互作用提供信息，这对于鉴定用来医治靶向的新途径和分子是必需的。例如，新辅助抗PD-I治疗的HCC的最近研究整合了偶联scRNAseq/TCRseq与多个空间mRNA（MERFISH，RNAscope）和多重免疫荧光染色以鉴定与病理反应相关的TiME特征。在这项研究中，病理反应与共定位的“细胞三联体”相关，这些细胞三联体包含PD-1hi CD 8 + T效应细胞、CXCL 13 hi CD 4 + Tconv细胞和表达多种共刺激分子（CD 80/86）和高MHC II沿着多种共抑制分子（PD-L1/L2）的活化DC。这些发现与肿瘤抗原交叉呈递作为通过新辅助ICB产生抗肿瘤免疫的重要机制的假设作用一致。
因为ICB功效是基于其以下能力来预测的：1）增强从头抗肿瘤T细胞的引发，2）“重新激活”功能失调的（通常称为耗尽的）肿瘤特异性T细胞，和3）释放直接肿瘤杀伤，所以它用于在新辅助ICB之前和响应于新辅助ICB的肿瘤特异性T细胞功能是临床益处的关键决定因素。虽然大多数研究广泛地观察T细胞而不考虑抗原特异性，但最终是肿瘤特异性T细胞，其数量和功能状态与抗肿瘤免疫最相关。这些细胞的检测在大多数癌症类型中是具有挑战性的，因为它们的频率即使在肿瘤内也相比来说较低，并且在外周血中低几个数量级。使用四聚体分离，Rizvi et al.首先证明了可以在用抗PD-I治疗的晚期转移性NSCLC患者的外周血中检测到新抗原特异性T细胞。这些T细胞在PD-1阻断后频率增加，并与放射学反应相关。虽然这只是一项单患者病例研究，但它为在新辅助治疗背景下接受ICB的患者中做全面的免疫分析奠定了基础。实际上，随后在用新辅助抗PD-I治疗的NSCLC患者的外周血中检测到新抗原特异性T细胞，并且这些T细胞克隆型的外周动力学与该患者的临床过程一致。在来自同一试验的另外的患者中，发现在肿瘤内占据最大“空间”的T细胞克隆型在治疗后也在外周中扩增，这与病理学反应相关。与此一致，在胃癌的新辅助ICB研究中，克隆扩增评分和过度扩增的外周血T细胞克隆的增殖与部分病理学应答相关。此外，在III期黑色素瘤中比较新辅助剂/辅助剂与辅助剂伊匹单抗+纳武单抗的小型随机化研究中，用新辅助剂/辅助剂ICB的肿瘤驻留T细胞克隆的外周扩增大于用单独的辅助剂ICB。有必要注意一下的是，这三项研究没有证实扩增克隆的特异性，但与新辅助ICB可以诱导具有寻找和破坏远处微转移的潜力的肿瘤反应性T效应细胞的全身性扩增和活化的假设一致。最终，正在进行的研究分析验证的肿瘤特异性T细胞的动力学将提供ICB如何调节抗肿瘤T细胞免疫的关键理解。
最近，结合scRNAseq/TCRseq的抗原刺激的T细胞的批量TCRseq的综合分析已经允许对用新辅助ICB治疗的患者的肿瘤、肿瘤引流淋巴结和外周血内的个体肿瘤特异性T细胞进行转录谱分析。在使用这一些技术对来自新辅助ICB治疗的NSCLC患者的CD 8 T细胞的原始研究中，Caushi et al.结果为，在MPR和非MPR肿瘤中均可以在单细胞水平检测到新抗原反应性TIL，并且这些细胞在很大程度上具有组织驻留记忆（TRM）程序。即使新抗原特异性CD 8细胞的频率在MPR肿瘤中不高于非MPR肿瘤，但来自非MPR肿瘤的TIL具有更高的免疫检查点表达、更低的IL 7 R表达，并且因此对IL-7刺激的反应减弱，这在某种程度上预示着相对于来自MPR肿瘤的TIL，肿瘤抗原特异性增殖能力减弱。为了支持ICB的全身影响，本研究还发现，来自肿瘤具有病理性CR的患者的新抗原特异性T细胞在外周血中瞬时扩增，并经历从记忆重编程为效应物样状态。
Luoma等人的研究将偶联的scRNAseq/TCRseq应用于来自接受新辅助纳武单抗与或不接受伊匹单抗的患者的头颈鳞状细胞癌。与Caushi等人类似，Luoma显示对肿瘤相关抗原（TAA）具有特异性的CD 8 TIL几乎全部位于TRM簇中。他们分析了ICB前后的组织，显示治疗前存在TAA特异性TRM细胞的克隆扩增，以及治疗前未检测到的ICB后少数新克隆。MPR肿瘤具有比非MPR肿瘤大得多的预先存在的和从头TAA特异性克隆的扩增，并且这些克隆也在血液中扩增。即使TAA特异性TIL在ICB处理后保留了TRM转录程序，它们也具有细胞毒性基因以及某些活化诱导的免疫检查点基因（如LAG 3）的增加的表达。
在可以限制抗肿瘤效应T细胞应答的TiME中的多种细胞类型中，调节性T细胞（Treg）在鼠模型中突出，其中FoxP 3 + Treg细胞的遗传耗竭介导甚至对常规ICB不应答的侵袭性肿瘤的消退。来自新辅助抗PDl治疗的NSCLC的肿瘤浸润性Treg的最近scRNAseq分析揭示了9个不同的亚群。由高水平的0X 40、GITR和LAG 3定义的一个群体具有高抑制活性并且在无应答肿瘤中更常见。相反，具有Th 1特征的Treg群体与应答相关。这些意想不到的发现表明，靶向Treg的特定亚群将对抗肿瘤免疫具有不一样的结果。例如，0X 40和GITR激动剂抗体未能在癌症患者中发挥临床益处原因是它们实际上刺激TIL-Treg的抑制性亚群以抑制抗肿瘤T效应子应答。尽管迄今为止，已经研究肿瘤反应性TIL的患者数量很少，但这些研究为实验和计算方式奠定了基础，以询问ICB直接靶向的细胞的功能编程：识别肿瘤的细胞。
新辅助ICB有可能产生大量的生物标本，因此，大量的信息周围的机制基础的反应和抵抗免疫治疗。虽然迄今为止报道的大多数深入科学分析都集中在T细胞应答上，但TiME（和肿瘤引流淋巴结）的多种非T细胞元件，包括非造血细胞类型，可能会影响抗肿瘤免疫；这些元件必须与相关的肿瘤特异性T细胞（包括空间共定位）相一致地进行谱分析。通过适当的规划、组织和“团队科学”方法，许多有一定的影响力的相关研究可以来自单一的临床试验，这将最终推动生物标志物和治疗的发展，以改善患者的预后。
尽管大多数新辅助ICB临床试验的随访时间仍然相对较短，但似乎出现了许多主题，特别是来自中位随访≥2年的试验数量持续不断的增加。首先，对于给定的肿瘤类型，当在手术前给予时，显示出针对晚期不可切除疾病的显著功效的新辅助抗PD-（L）1和含抗PD（L）1的组合方案也倾向于介导相当大比例的病理学应答。也就是说，根据通常用于评估不可切除癌症中肿瘤消退的放射学标准，不可能直接比较新辅助治疗背景下的病理学应答与临床应答，因为ICB后的放射学应答倾向于低估病理学应答，如上文针对NSCLC所讨论的。在病理MPR（包括pCR）中，存活肿瘤被纤维化、淋巴浸润和类似淋巴结滤泡的三级淋巴结构所取代，这些结构在放射学扫描中可能表现为可测量的肿瘤。新辅助ICB出现的第二个主要主题是病理反应的深度与EFS/RFS的维持的时间相关。在TNBC和NSCLC的两项成功的新辅助ICB加化疗注册试验中，在手术切除时达到pCR的患者中就没有复发。这表明，病理学反应是成功诱导全身抗肿瘤免疫和消除手术时放射学上不可见的微转移的替代。Taube及其同事在肺癌中完善了这一概念，证明了残余存活肿瘤比例与EFS之间的分级相关性，并提出了完善预后分级系统的机会。事实上，一些在原发性肺肿瘤中具有甚至轻微病理学应答的患者仍旧能经历延长的EFS，这表明引发的抗肿瘤T细胞应答可以潜在地对远距离微转移性疾病比对大体积原发性肿瘤更有效。应用于新辅助治疗后切除的肿瘤的特定细胞标志物和标志物组合的更复杂的空间分析将可能比常规H&E染色上残留存活肿瘤百分比的简单评估更能揭示全身反应。最终，从询问新辅助治疗后肿瘤样本收集的信息可以指导手术后（即，免疫治疗）的个性化应用。辅助治疗以进一步提升患者的结果。尽管许多当前的新辅助试验被设计为在手术后继续ICB，但这伴随着毒性风险，并且有几率存在诸如实现pCR的那些患者不需要继续治疗。除了对切除的肿瘤进行更复杂的分析之外，用于检测微小残留疾病的改进的血清ctDNA和蛋白质组学技术将可能单独或与病理学反应结合作为重要的生物标志物出现，以指导手术后治疗或观察。
第三个新出现的主题是新辅助ICB不但可以引发全身抗肿瘤免疫，而且还可以以积极的方式影响手术切除。这一直是高危早期乳腺癌标准新辅助化疗的情况。对于通常影响头部和颈部的高度ICB反应性皮肤癌，例如MCC和晚期cSCC，常规摘除手术可能会高度毁容，新辅助ICB的肿瘤缩小可以缩小手术野并显著改善美容和功能结局。同样地，在dMMR直肠癌中，新辅助ICB能够尽可能的防止对改变生活的常规手术的需要；在原发性HCC中，许多诊断时可切除的边缘性肿瘤具有高的术后复发风险，可以在新辅助ICB后用意向性治愈手术成功治疗。事实上，对某些癌症，如黑色素瘤和dMMR直肠癌，在临床试验中正在探索在实现完全病理或临床反应的患者中完全避免手术的可能性。
在科学方面，新辅助ICB后活切除标本的单细胞分析，特别是使用高维流式细胞术和偶联的RNAseq/TCRseq来分析经验证的肿瘤新抗原特异性T细胞克隆，已经产生了将独特的T细胞转录程序与免疫治疗反应性相关联的重要见解。大多数肿瘤特异性T细胞表达CD 39、CXCL 13和LAG-3，并且具有转录程序，其具有功能障碍（高检查点表达和杀伤抑制性受体表达）、组织驻留（高CD 103和典型的组织驻留转录因子Hobit）和部分激活（例如，高CD 103和典型的组织驻留转录因子Hobit）特征。高MHC II类表达在新辅助ICB后具有病理学应答的肿瘤与无应答的肿瘤的比较显示，来自应答肿瘤的CD8细胞具有较低的免疫检查点表达、较高的IL7R表达和偏向效应CTL的一般程序。与CD8效应细胞相反，Treg能代表肿瘤内的显著免疫抑制力。如上文对于NSCLC所述，与无响应肿瘤相比，来自响应新辅助ICB的肿瘤的Treg具有不一样的亚组组成。从高维分析，特别是单细胞和空间分析中获得的信息的量子飞跃也揭示了不同肿瘤类型中免疫微环境的显著差异。
随着新辅助ICB及其与靶向激酶抑制剂、化疗、其他免疫疗法和实验性药物的组合的科学见解和临床益处的激增，这一转化研究领域仍然只是触及了可能性的表面。数百项新辅助ICB试验正在进行中-它们一定要经过精心设计，以回答癌症免疫治疗新时代最突出的临床和科学问题。