【48812】核酸常识系列（四）

  许多人总是忧虑混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 形成损坏，实际上大可不必如此当心。剧烈的混匀操作，是会对部分打断大分子的基因组 DNA， 但该损坏效果不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个巨细，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是彻底适用的。假如要求的片段非常大，如构建文库用，则不能够运用剧烈的混匀办法，而只能来回温文倒置混匀。

  简直没有人会以为 EP 管的质量会与核酸抽提的操作有关，与某些现象（如核酸在-20℃ 保存一天后产生了降解）有联系，但事实是， EP 管的质量确实与核酸抽提的质量以及核酸保存时的安稳性有关。

  硅化能够给我们供给最高质量的 EP 管，使某些古怪的现象消失或许非常大程度上减轻。最糟糕的 EP 管对液体有较强的吸附力，在倾倒液体时残留多，核酸在管中保存的进程中会产生变性。这样的管子很有商场的，因为廉价；而正因为廉价，其资料总是不令人定心的。只要硅化过的低吸附 EP 管， 才或许依照规范操作取得满足的成果。不然，某些操作过程有必要调整，才能够得到安稳的质量。

  核酸抽提去除蛋白质，先用酚与氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。运用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更加好。继而用氯仿抽提可除掉核酸制品中残量酚。

  酚与氯仿对错极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失掉水合状况而变性。通过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因此与水相别离，沉积在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分隔。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最基层。

  坏处：酚的变性效果大，但酚与水相有某些特定的程度的互溶，大约 10％～15％的水溶解在酚相中，因此丢失了这部分水相中的 DNA，而氯仿的变性效果不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走 DNA。

  在抽提进程中，混合运用酚与氯仿效果最好，经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，因为酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第2次变性蛋白质，此刻一同将酚带走。也能够在第2次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）运用。

  在抽提 DNA 时，为了混合均匀，有必要剧烈振动容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻挠相互间的充沛效果。参加异戊醇能降低分子表面张力，所以能削减抽提进程中的泡沫产生。一般都会选用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也可选用酚、氯仿与异戊醇之比为 25：24:1（不必先制造，可在临用前把一份酚加一份 24：1 的氯仿与异戊醇即成），一起异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及基层有机溶剂相保持安稳。

  在基因操作试验中，挑选缓冲液的首要原则是考虑 DNA 的安稳性及缓冲液成分不产生搅扰效果。

  磷酸盐缓冲体系（pKa＝7.2）和硼酸体系（pKa=9.24）等尽管也都契合细胞内环境的生理规模（pH），可作 DNA 的保存液，但在转化试验时，磷酸根离子的品种及数量将与 Ca2＋产生 Ca3(PO4)2沉积。

  在 DNA 反响时，不同的酶对辅助因子的品种及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，选用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲体系，因为缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的搅扰效果，故在提取或保存 DNA 时，大都选用Tris-HCl 体系。

  TE缓冲液含有Tris-HCl及EDTA两种物质，呈弱碱性，对DNA的碱基有保护性，DNA在TE缓冲液中的安稳性较好，不易损坏其完整性或产生开环及开裂，所以提取好的DNA最好也放在TE缓冲液中保存。

  基本上，核酸在保存中的安稳性，与温度成反比，与浓度成正比。尽管也有部分试验人员发现， -20℃保存的 DNA 比-70℃保存的安稳。

  假如温度适宜，保存中核酸产生降解或许消失，最首要的原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的 pH 值不适宜导致的水解。还有一个便是 EP 管对核酸的影响（核酸必定会与装它的容器的接触面产生反响，到达某种均衡），EP 管的原料，或许吸附核酸，其次还能够诱导核酸的结构产生某些改变，如变性。在核酸的浓度比较高时，这个现象或许调查不到；当核酸浓度很低时，则清楚明了了。