一文了解蛋白酶K！

  蛋白酶K有着非常强的蛋白酶活性，能够将实验室的其它蛋白酶解，所以蛋白酶K需要专门的产地、仪器设施、人员来进行研发与生产。 蛋白酶K在体外诊断、药物加工等生物医药领域有着无法替代的重要作用。

  与行业里的那些脍炙人口的DNA聚合酶、RNA聚合酶等相比，蛋白酶K显得很低调，以至于我们长期忽视了它的重要性。随着这次新冠疫情的爆发，蛋白酶K的需求量暴增，国内外的供应量远跟不上消耗量，大家才突然意识到蛋白酶K是如此的重要。

  蛋白酶K(Proteinase K)，属丝氨酸蛋白酶类，1974年，Wolfgang Ebeling等利用沉淀、离子交换层析和凝聚层析等方法在林伯氏白色念球菌的培养基中分离纯化出蛋白酶K。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Keratin)为唯一碳氮源的环境中生长，即能够消化角蛋白，因此被命名为蛋白酶K(Proteinase K)。蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28.9kDa。蛋白酶K家族包含了各种由真菌、酵母及革兰氏阴性细菌分泌的细胞内肽酶。

  蛋白酶K具有稳定的结构、极高的酶活力和广泛的底物特异性，但偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸羧基端连接的肽键。与其它的蛋白酶相比较，蛋白酶K具有高活力和高稳定性，其酶活不会被尿素、SDS和EDTA等变性剂抑制，且在高温、高盐或较高的pH等条件下，蛋白酶K仍能保持较高活性。因该酶在较广的pH范围(4～12.5)内及高温(50～70℃)均有活性，在提取DNA和RNA的缓冲液中具备极高的活性，可用于质粒或基因组DNA、RNA的分离，是DNA提取的关键试剂。

  蛋白酶 K 是现有蛋白酶中活性最高的品种，在 pH 4 到 pH 12 的条件下均有活性，反应温度介于 0～75ºC 之间。在常用浓度的 SDS、尿素或 EDTA 存在时亦很稳定。酶切割位点在脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能够适用于所有蛋白质的降解。

  《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）是2018年5月1日实施的一项中华人民共和国国家标准，归口于中国标准化研究院。《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）规定了蛋白酶K产品的术语和定义、技术方面的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017）适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产和检测。

  近年来，随着研究的深入，蛋白酶K的应用不仅仅局限在医疗诊断及科研领域。在实现规模化工业生产的前提下，蛋白酶K还可以替代作用范围较窄的其它蛋白酶，应用于工业制革、食品加工、饲料生产、造纸等行业中。另外，蛋白酶K也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料，去除不必要的蛋白质杂质。蛋白酶K目前主要使用在于基因诊断试剂盒、基因组 DNA 提取试剂盒、RNA 提取试剂盒中去除核酸酶和其它蛋白污染。

  对于新冠病毒，核酸扩增试验时的处理、抽提、扩增为高风险，因此扩增前需要对标本先行灭活病毒，蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采样液的重要组分，可裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并能灭活病毒，让病毒的蛋白变性，失去活性而“死掉”，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性。

  蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离，在提取高分子量核酸时有很大的优势。蛋白酶K还常被用于RNA提取过程中RNase的抑制和降解。RNA的质量对于Northem印迹及杂交分析、cDNA合成及体外翻译等实验的成败至关重要。而RNA极不稳定、易于被广泛存在的RNase降解，因此利用蛋白酶创造一个无RNase的环境、严格防止RNase污染是成功提取RNA的关键。

  蛋白酶K在原位杂交技术中通常用于杂交前标本的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以利于检测探针的穿透，提高检测的敏感性。

  病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主，蛋白酶K可以对病毒衣壳蛋白进行破坏，从而干扰病毒与宿主细胞的结合。在一定条件下，67.51ug/mL浓度的蛋白酶K处理lh对纯水和生活垃圾污水中病毒灭活率分别达到了99.4％和49.4％，处理3h的灭活率分别是99.9％和81.8％，灭活病毒的效果明显。用蛋白酶K进行病毒灭活的优点是消毒剂本身无害，而且不产生有害消毒产物，所以这是一种高效环保的方法。

  病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主，蛋白酶K可以对病毒衣壳蛋白进行破坏，从而干扰病毒与宿主细胞的结合。在一定条件下，67.51ug/mL浓度的蛋白酶K处理lh对纯水和生活垃圾污水中病毒灭活率分别达到了99.4％和49.4％，处理3h的灭活率分别是99.9％和81.8％，灭活病毒的效果明显。用蛋白酶K进行病毒灭活的优点是消毒剂本身无害，而且不产生有害消毒产物，所以这是一种高效环保的方法。

  蛋白酶K能分解肉的肌纤维，结缔组织的蛋白质，甚至包括弹性蛋白及胶原蛋白，使蛋白质的各级空间结构发生明显的变化，部分肽键断裂，肉料吸水膨胀，质地变嫩，满足那群消费的人对肉类品质的要求。

  不管是在科研领域，还是在IVD领域，核酸提取都是最为基础的实验，因而蛋白酶K一直都是很重要的存在。然而过去，蛋白酶K的知名度远不及它所发挥的作用，这其中很大一部分原因是因为蛋白酶K的供需关系很稳定，很少有人会认为蛋白酶K的供给会是一个问题。

  全球新冠肺炎感染人数不停地改进革新高，新冠病毒传染性增强对疫情的防控无疑是产生更大的挑战，对新冠核酸检测的需求也不断的提高，蛋白酶K作为核酸检验测试试剂盒中用于检测样本前处理的重要组分，目前市场需求也不断加大。

  在核酸提取实验中蛋白酶K的工作浓度大约是50-200 μg/mL，正常的情况下，提取一个样本的核酸大约需要100 μg的蛋白酶K，而在实际使用的过程中，为增加核酸提取效率，经常会将蛋白酶K加量使用。新冠病毒的核酸检验测试带来了大量的蛋白酶K需求，蛋白酶K原有的供需平衡被迅速打破，蛋白酶K一夜之间成为了重要的防疫物资。

  虽然虽疫情的发展，蛋白酶K的重要价值被人们所重视，然而尴尬的是，由于蛋白酶K的过度低调，以至于国内很少有企业涉猎过蛋白酶K的生产，当人们想建立蛋白酶K的生产的基本工艺时，却发现蛋白酶K是一个极其特殊的蛋白，短时间内扩大蛋白酶K的产能极具挑战性。

  蛋白酶K能够非特异性的降解大多数蛋白，对于表达宿主细胞导致非常严重毒性，因此蛋白酶K的表达量一般都很低。筛选高表达蛋白酶K的表达系统和菌株，通常要较长的周期。

  大规模发酵，引入大量色素和宿主核酸的残留，简单的纯化工艺很难除去这些杂质，而复杂的纯化又增加了成本和降低了回收率。

  蛋白酶K不够稳定，自己能酶解自己，在无保护剂时，37℃很难长期稳定保存。

  在制备蛋白酶K的冻干粉时，为了能够更好的保证冻干粉中蛋白酶K的固含量较大，需要在高浓度时加入冻干保护剂，但是蛋白酶K在浓度达到20mg/mL及以上时，很容易聚集形成沉淀，这给蛋白酶K的高固含量冻干带来非常大的困难。

  蛋白酶K有着非常强的蛋白酶活性，能够将实验室的其它蛋白酶解，所以蛋白酶K需要专门的产地、仪器设施、人员来进行研发与生产。 蛋白酶K在体外诊断、药物加工等生物医药领域有着无法替代的及其重要的作用。长期以来，我国实验室所用的蛋白酶K都是从各级代理商中买到的进口产品，下游产业严重依赖进口。随着新冠疫情的全球大流行，蛋白酶K供不应求，导致国内严重缺货，“卡脖子”效应明显。为了不受制于人，减少相关成本，国产蛋白酶K替代进口将成必然趋势。