重构工业菌让“细胞工厂”绿色高效

  对于工业细菌大肠杆菌来说，三羧酸循环（TCA循环）在其有氧生长过程中发挥着及其重要的作用——将碳源转化为细胞生物量。任何将碳通量从细胞生长转移到感兴趣的产物的尝试都会干扰天然代谢，并可能会影响碳效率。

  理论上，阻断TCA循环及其旁路能够大大减少碳耗散，促进好氧发酵中的化学生物合成。但三羧酸循环的阻断往往会干扰细菌的自然生长。

  近日，陶勇团队在有氧发酵条件下的减碳底盘研究中取得重要进展，设计重构一种全新的具有不完整三羧酸循环（TCA）的大肠杆菌底盘细胞，使有氧发酵的碳损失降到最低，进而达到微生物发酵减碳的目标，相关论文发表于《自然—通讯》。

  “有了这个底盘细胞，所有α酮戊二酸依赖型的酶催化反应都能够获得优化。能够说是‘一石多鸟’。”论文共同通讯作者、中国科学院微生物研究所研究员陶勇说。

  三羧酸循环是需氧生物体内都会存在的代谢途径，它将有机物质分解为二氧化碳和水，同时产生了大量的高能分子，是糖类、脂类和氨基酸的最终代谢通路。

  论文共同通讯作者、中国科学院微生物研究所项目研究员林白雪告诉《中国科学报》：“三羧酸循环是好氧生物生命所必需的循环。我们在这项研究中打断了三羧酸循环，这是一个很有挑战的事情。”

  这起源于10年前生产实践中的一个难题。2013年，青霉素由于易造成过敏而渐渐淡出患者的选择范围。但我国青霉素产能犹在。

  一向关注产业的陶勇团队注意到，青霉素的替代品、不易引起过敏的头孢菌素实际上和青霉素结构相差不大。如果能将青霉素转换为头孢菌素，一方面能够解决青霉素滞销的问题；另一方面也能用生物合成取代原本生产工艺中的化学反应，减少重金属污染。

  “有一种酶可以将青霉素转换为头孢菌素的母核，这个酶天然的作用对象是青霉素N，而我们生产的则是青霉素G。”陶勇介绍说，“当时中国科学院微生物所研究员杨克迁提高了酶对青霉素G的亲和力，但催化能力还是很低。”

  团队研究之后发现，要提升这个酶的催化能力，共底物α酮戊二酸是另一个必需品。而α酮戊二酸是三羧酸循环的中间代谢产物。但其通过外源添加的工艺成本过高，如何绿色高效地向青霉素到头孢的催化反应中供应α酮戊二酸成了难题中的难题。

  “既然外源行不通，那就试试内源。”陶勇说，α酮戊二酸在青霉素到头孢的催化反应中会生成琥珀酸，而在三羧酸循环中α酮戊二酸同样会生成琥珀酸。团队不禁设想，如果能让三羧酸循环中的α酮戊二酸在催化反应中转化为琥珀酸，不就解决了内源供应问题吗？

  基于此，研究人员将三羧酸循环中α酮戊二酸到琥珀酸的通道断开，把青霉素到头孢的酶催化反应偶联到循环之中，这样既能在细胞正常生长的同时为酶提供必需的供底物，又解决了α酮戊二酸依赖型的一系列酶的催化能力不够问题。

  林白雪说：“我们当时只改了这一步，就把酶催化效率提高了11倍。”2015年，该研究成果发表于《美国科学院院刊》（PNAS）。

  新的挑战又出现了。陶勇回忆道，“三羧酸循环断了之后，细胞只能在实验室提供的营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，一旦移到工业生产所用的无机盐培养基中，细胞就不长了。”

  自然界中有些微生物天生不具有三羧酸循环，但也能在有氧条件下生存。这让论文第一作者、当时在中国科学院微生物研究所读博士的周航兴奋起来：是不是能够通过人为进化让切断三羧酸循环的菌调节自身来适应无机盐环境呢？

  周航开始了为期11周的适应性进化实验。“我们先把没有完整三羧酸循环的菌放在牛肉膏蛋白胨培养基中生长，看到有菌长起来后就把它整体稀释十倍，取其十分之一转接到葡萄糖培养基里。一共做了45轮循环之后发现，没有完整三羧酸循环的菌也能够在无机盐培养基中正常生长了。”随后，小组成员开始着手基因组分析。

  2017年，陶勇前往美国参加会议。细菌代谢流分析学者、美国特拉华大学教授Maciek R. Antoniewicz对陶勇团队正在开展的研究颇感兴趣，主动提出能够在一定程度上帮助他们利用同位素标记做定位。根据对碳13代谢流数据分析，陶勇团队终于发现了不完全三羧酸循环下细胞仍能正常生长的奥秘。

  在细胞中央代谢提供的12个分子中，α酮戊二酸、草酰乙酸和丁二酰辅酶是三羧酸循环所必须的。

  “通过代谢流分析不难发现，除去人工阻断循环的地方，还有两处没有流量通过，并且正常的三羧酸循环是顺时针流动的，进化后的菌中有一步是逆时针流动。”陶勇告诉《中国科学报》，“细胞很聪明，我们不让它从这边走，但它要活下去，它只好把另一步反应突变，调转方向，以此维持琥珀酰辅酶A的产生。”

  “大肠杆菌和很多好氧微生物一样，‘吃’进去的葡萄糖在三羧酸循环中会转化为二氧化碳。”周航说，二氧化碳的排放减少了直接用于产品合成的碳通量，从而对产品产量产生负面影响。因此，阻断三羧酸循环及其旁路能够大大减少碳耗散，促进好氧发酵中的化学生物合成。这也是科学家一直想要提高的有氧发酵中的生产效率问题。

  有没有办法让细胞不需要琥珀酰辅酶A，在工业化生产中提高生产效率？周航又一次钻进文献里寻找头绪。

  终于，他们发现，“将外源乙酰辅酶A依赖途径引入到大肠杆菌中，使大肠杆菌不需要依赖琥珀酰辅酶A。”林白雪说，改造后的大肠杆菌在三羧酸循环缺失的情况下，在无机盐中长得非常好。

  团队构建了一种没有功能性三羧酸循环的大肠杆菌菌株，该菌株可当作化学物质生物合成的通用底盘。利用这个底盘细胞，他们开始尝试不同化学品的生物合成，实现了4种不同化学品的生物合成，提高了产物转化率。

  研究团队进一步以左旋肉碱生物合成为突破口。左旋肉碱是人体内天然存在的一种类氨基酸物质，大范围的应用于食品添加剂、饲料添加剂、药物治疗等多个领域，具有日益旺盛的市场需求。预计2025年左旋肉碱的市场规模将达到2.5亿美元。

  陶勇团队利用上述工业底盘细胞构建微生物细胞工厂，实现了左旋肉碱的绿色高效生物制造。项目获得具有自主知识产权的关键技术，技术达国际领先水平，并已完成技术转让，实现产业化，生产后经济效益可观。“左旋肉碱项目转化的实现，说明这个底盘细胞可以‘一石多鸟’，实现了研发的闭环。”林白雪说。

  陶勇说，这项研究成果不仅打破了从实验室到产业化的关键瓶颈，更为微生物发酵减碳提供了新的思路。未来，这座绿色高效的“细胞工厂”将会陆续赋能多种化学品合成。陶勇说：“在减少二氧化碳排放的同时，提高合成产物得率，我想这应该是我们做绿色生物制造最理想的目标，也是我们从始至终在努力的方向。”