AmpC酶抑制剂筛选方法的建立及136种中药材活性评价

  内酰胺类抗生素以其良好的抗菌活性和选择性，至今仍是临床抗感染的首选药物。然而，就像迄今为止在临床环境中使用的任何其他抗菌药物一样，使用后很快都会出现耐药菌株内酰胺环，致使药物失活，失去其杀菌效应，是细菌耐药性最重要和临床相关的机制

  研究显示，美国住院患者对广谱头孢菌素的耐药率从2009年的5.46%增加到2017年的12.97%[10]；另有资料显示国内患者不仅对头孢曲松、哌拉西林、头孢哌酮的耐药率已超过50%，而且对第4代头孢菌素类药物头孢吡肟的耐药率也呈上涨的趋势（由21.15%上升至40.63%）[11]。引发头孢类抗生素耐药的产AmpC酶菌株正在以罕见的速度增加，尤其持续高产AmpC酶和质粒介导的AmpC酶菌株以及产AmpC酶多重耐药细菌的出现和广泛传播[12-13]，导致大多数临床β-内酰胺酶抑制剂对AmpC酶均无效，临床对该类细菌感染的治疗愈发困难。

  针对临床耐药较为严重的头孢类抗生素耐药问题，除了加大力度进行新型抗生素的研发，如何使现有的具有优良抗菌活性头孢类抗菌药物继续发挥作用显得很重要。进行AmpC酶抑制剂的研究是延长现有头孢类抗生素生命周期的良好举措。目前临床应用最有效的AmpC酶抑制剂主要为阿维巴坦和法硼巴坦，但研究显示随着当前耐药性的发展，对阿维巴坦不敏感临床分离株的报道日渐增多[14]，因此进行新型AmpC酶抑制剂筛选和挖掘研究不仅迫切而且意义重大[15]。

  良好的筛选方法是发现β-内酰胺酶抑制剂类药物的前提。尽管此前已有研究报道了A类β-内酰胺酶抑制剂的快速筛选方法[16]，但目前国内关于AmpC类酶抑制剂筛选方法的研究尚未见相关报道。中药不仅是新药发现的良好资源，更在治疗传染病方面具有天然而独特的优势，因此，逐步发展和利用中医药治疗耐药菌引起的临床感染具备极其重大意义。基于此，本研究建立了一种快速、高效、稳定的AmpC酶抑制剂筛选方法，并通过136种中药水提物的初步活性筛选及协同抗菌活性验证，以期为AmpC酶抑制剂的筛选以及为从中药中挖掘抗耐药提供实验依据。

  136种中药材（表1）购自甘肃省兰州市黄河药材市场，由兰州理工大学杨林副教授鉴定均符合《中国药典》2020年版规定。

  头孢菌素酶（批号F26HS176600）购自上海源叶生物科技有限公司；头孢硝噻吩（批号E2104156）购自长沙俄里翁生物科技有限公司；阿维巴坦钠（批号G2122030）、碘硝基氯化四氮唑蓝[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchloride hydrate，INT，批号D2126248]、青霉素（批号B2104061）、头孢唑啉钠（批号I2107357）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；头孢呋辛钠（批号2210612V）、头孢西丁钠（批号21040231）、头孢曲松钠（批号21093371）均购自扬子江药业集团有限公司；盐酸头孢替安（批号20210306）购自南京海辰药业股份有限公司；克拉维酸钾（13）购自中国食品药品鉴定研究院；Na2HPO4、KH2PO4、甲醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等常规试剂均为分析纯。

  UV2102PC型紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；FA2104型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）。

  分别称取136种中药材各100 g，加入10倍量蒸馏水，水浴回流提取1 h，提取3次。将滤液趁热滤过，合并滤液，减压浓缩后放入50℃烘箱至完全干燥，得到各药材水提物浸膏。

  2.2.3头孢硝噻吩溶液精密称取头孢硝噻吩1 mg，用PBS配制成0.1 mg/mL的底物溶液，−20℃保存。

  2.2.4阿维巴坦钠溶液精密称取阿维巴坦钠1 mg，用PBS缓冲液溶解配制成1 mg/mL的溶液后，稀释为1.0 μg/mL的溶液，−20℃保存。

  2.2.5底物溶液精密称取6种底物各1 mg，用PBS溶液配制成0.2 mg/mL的溶液，−4℃保存。

  2.2.6克拉维酸钾溶液精密称取克拉维酸钾1 mg，用PBS缓冲液溶解配制成1 mg/mL的溶液后，分别稀释为0.5、0.1 mg/mL的溶液，−20℃保存。

  为了得到筛选AmpC酶抑制剂的最优反应底物，选取头孢唑啉钠、头孢呋辛钠、头孢西丁钠、盐酸头孢替安、头孢曲松钠和头孢硝噻吩6种具有β-内酰胺环与氢化噻嗪环骈合结构母核的头孢类抗生素作为底物进行评价[17-20]。实验时，分别将其配制为质量浓度为0.1 mg/mL的底物溶液，添加400 U/mL的AmpC酶溶液振荡混匀，待完全反应后，全波长扫描分别记录反应前后的特征吸收峰，记录扫描数据，绘制谱图，通过比较分析获得最优底物及检测波长。

  在300 μL反应体系中，依次加入100 μL PBS溶液、100 μL酶溶液（400 U/mL）和100 μL质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的底物溶液。充分混匀后，测定其在30℃、489 nm波长下5 min内每隔10 s的吸光度（A）值，记录数据，计算反应初速率（K）和线性相关系数（R2），并设置3组平行，以确定反应的最适底物浓度。

  在同样反应体系下，保持底物质量浓度为0.1 mg/mL不变。改变酶浓度，将酶溶液浓度依次设定为100、200、400、600、800 U/mL 5个梯度，按“2.4”项下办法来进行测定，并设置3组平行，以确定反应的最适酶浓度。

  同样体系中，在保证反应进行完全的前提下，测定其在一段时间内的A变化，将时间依次设定为2、5、7、10 min，记录数据，按“2.4”项下办法来进行测定，并设置3组平行，以确定筛选体系的最佳反应时间。

  在同样体系下，保持底物质量浓度为0.1 mg/mL、酶浓度为400 U/mL不变。将配制好的底物、酶以及PBS溶液各分装为5份，将温度依次设定为10、20、30、40、50℃，按“2.4”项下办法来进行测定，并设置3组平行，以确定筛选体系反应的最适温度。

  在同样反应体系下，保持底物质量浓度为0.1 mg/mL、酶浓度为400 U/mL不变，将100 μL PBS溶液用100 μL有机溶剂取代，按“2.4”项下办法来进行测定，并设置3组平行，测定不同体积分数的甲醇、丙酮、DMSO和乙醇对酶反应体系的影响，按“2.4”项下方法计算不同浓度有机溶剂的抑制率，以确定不同有机溶剂对方法的影响。

  保持反应体系不变，设定底物质量浓度为0.1 mg/mL、酶浓度为400 U/mL。按“2.4”项下方法计算不同质量浓度的克拉维酸钾和阿维巴坦钠对AmpC酶的抑制率，以验证方法的可靠性。

  采用高通量筛选实验评估和验证中使用最广泛的参数Z′来评估AmpC酶抑制剂筛选体系的可靠性：0.5≤Z′＜1，说明筛选体系中样品信号分布与参照信号分布的分离程度良好，筛选方法可靠；0＜Z′＜0.5，表示中等程度的分布分离，说明筛选方法有待逐步优化。Z′能够最终靠阳性对照和阴性对照的标准偏差和均值来计算[21]。

  Z′＝1－3×(阳性对照标准偏差＋阴性对照标准偏差)/(阳性对照平均值－阴性对照平均值)

  保持反应体系不变，按照上述所确定的最佳筛选条件，按“2.4”项下方法以阿维巴坦钠为参比，分别连续3 d、每天3次不同时间测定抑制率，以此评价AmpC酶抑制剂筛选方法的稳定性。

  精密称取各中药水提物粉末1 mg，用配制好的PBS溶液或10%甲醇和乙醇溶解样品，溶解成1 mg/mL的待测溶液。按照“2.9”项下优化反应体系进行测定，计算各中药水提物对AmpC酶的抑制率。

  将96孔板放置超净台紫外灯下照射12 h后灭菌待用。以肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）为指示菌，活化菌株并配制至0.5麦氏比浊浓度后，再将其稀释100倍待用[22]。以青霉素为抗菌阳性对照，用无菌PBS配制成质量浓度为8 mg/mL的母液，以2倍梯度无菌稀释成10个梯度待用；以阿维巴坦钠为酶抑制剂的阳性对照，用无菌PBS配制1 mg/mL阿维巴坦钠母液，5倍梯度稀释成10个不同质量浓度梯度待用；待测样品用无菌PBS配制20 mg/mL母液，2倍梯度稀释成10个不同质量浓度梯度待用。设置空白组（青霉素50 μL＋PBS 50 μL＋菌液100 μL）、阳性对照组（青霉素50 μL＋阿维巴坦钠50 μL＋菌液100 μL）、样品空白组（中药50 μL＋PBS 50 μL＋菌液100 μL）、样品组（青霉素50 μL＋中药50 μL＋菌液100 μL）。将添加药液及菌液的96孔板用保鲜膜密封后放置于37℃恒温摇床中培养24 h后取出，在超净台中向每孔中加入20 μL的染色剂INT，静置30 min后观察结果。

  选取6种具有β-内酰胺环与氢化噻嗪环骈合结构母核的不同底物，加酶完全反应后进行全波长扫描，结果如图1所示，不同筛选底物头孢呋辛纳、头孢西丁钠、盐酸头孢替安、头孢曲松钠与AmpC酶反应前后，组成体系中底物/产物的特征吸收峰分别出现在235 nm/279 nm、236 nm/234 nm、259 nm/200 nm、240 nm/232 nm处，差异不明显。而AmpC酶头孢唑啉钠、头孢硝噻吩反应的底物/产物的特征吸收峰分别出现在271 nm/289 nm、389 nm/491 nm处，具有较明显差异。进一步通过K值和R2的比较显示，相较头孢硝噻吩，以头孢唑啉钠为反应底物时存在很明显的反馈抑制现象。因此，本研究将头孢硝噻吩作为最适底物用于后续的筛选研究。且为了尽最大可能避免底物对吸光度的干扰，选择产物489 nm作为AmpC酶抑制剂筛选体系的最佳波长。

  由表2可知，保持酶浓度不变，K随着底物质量浓度升高的变化为先升高后降低，当底物质量浓度为0.10 mg/mL时，K达到最大，酶代谢反应线性相关性最好（R2＝0.994 5），因此为了方法的稳定性和筛选结果的可靠性，以0.10 mg/mL为本方法筛选的最佳底物浓度。

  由表3可知，保持底物质量浓度为不变，将酶溶液设置为5个浓度梯度，发现K值随着酶浓度的增加先升高后降低，在酶浓度600 U/mL时达到最高；当酶浓度为200 U/mL时R2最大，线性相关性最好；考虑到K的变化和方法的灵敏性，酶浓度为400 U/mL时K值较大，线性相关性较好，考虑确定400 U/mL为本方法的酶筛选最优浓度。

  如表4所示，当酶浓度为400 U/mL、底物质量浓度为0.1 mg/mL时，在反应7 min内，酶促反应的线性关系稳定。为了更好的提高AmpC酶抑制剂筛选体系的筛选效率，将筛选时间确定为5 min。

  如表5所示，随着温度增加K值呈先升高后下降的变化趋势，当温度在30℃时K值最大，线性相关性较好，因此将30℃作为AmpC酶抑制剂筛选的最优温度，以保证筛选结果的可靠。

  如表6所示，以去离子水为对照时，抑制率变化不超过1%，甲醇和乙醇体积分数保持在30%以下时，对AmpC酶抑制剂筛选方法的影响较小，而丙酮和DMSO体积分数保持在10%以下时对AmpC酶抑制剂筛选方法的影响较小；综上，为了筛选结果的可靠性，对于磷酸缓冲溶液难溶的样品，用有机溶剂进行溶解时，需要仔细考虑有机溶剂类型和体积分数对方法的影响。

  如表7所示，克拉维酸钾对AmpC酶没有明显抑制作用，与文献报道一致[23-24]，而阳性对照阿维巴坦钠随着质量浓度的升高，对AmpC酶的压制效果逐渐增加，呈剂量相关性，提示本研究搭建的方法稳定可靠，能够适用于后期的筛选。进一步通过比较，阳性对照阿维巴坦钠质量浓度在1.0 μg/mL其抑制率为86.70%，因此最终确定方法的阳性对照质量浓度为1.0 μg/mL用于后续筛选研究可靠性的参照。

  Z′因子的计算结果为0.94，在0.5～1.0内，符合高通量筛选的要求，说明本研究建立的AmpC酶抑制剂筛选体系稳定可靠。

  对1.0 μg/mL的阿维巴坦钠进行连续3 d各6次的抑制率测定，测定的RSD分别为1.00%、1.37%、1.15%，RSD均小于2%，说明搭建筛选方法的稳定性和重复性好，可用于AmpC酶抑制剂的筛选。

  根据上述所建立的AmpC酶抑制剂筛选方法，对136种中药水提物进行初步活性筛选，结果如表8所示。抑制率低于40%的有115种中药材，占比84.56%；抑制率为40%～50%有6种中药材，占比4.41%；抑制率为60%～70%有3种中药材，占比2.21；抑制率为70%～80%有7种中药材，占比5.15%；有5种中药提取物的抑制活性大于80%，分别为桑寄生（86.22%）、赤芍（85.30%）、红景天（84.26%）、千斤拔（83.83%）、石见穿（83.37%），占比3.68%。该结果为中药是筛选AmpC酶抑制剂药物的良好资源。

  由协同抗菌活性测定结果可知青霉素对耐药肺炎克雷伯氏菌（ATCC700603）表现出较弱的抗菌活性，其单独抗菌的最低抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）为2 mg/mL；而当添加阿维巴坦钠（稀释质量浓度为0.04 mg/mL）与青霉素联用时，青霉素MIC降低为0.1 mg/mL，表明阿维巴坦钠显著改善了青霉素的抗菌活性；相较青霉素，桑寄生显示了非常弱的抗菌活性，其单独抗菌的MIC为20 mg/mL；当添加桑寄生提取物（稀释质量浓度为0.04 mg/mL）与青霉素联用时，青霉素MIC降低为0.8 mg/mL，表明桑寄生也可以显著改善青霉素的抗菌活性。

  头孢类抗生素具有抗菌谱广、杀菌活性强、过敏反应少、不良反应小等特点，长期居全球抗感染药物市场排名第1（约占抗感染药物市场50%以上的市场占有率）[25]，是临床最常使用的抗生素之一。研究显示，AmpC酶编码在许多肠杆科菌和一些其他生物的染色体上，由其介导引发的头孢唑啉、头孢西丁等耐药性是头孢类抗生素临床使用最大的障碍[26]，并呈现上升态势，因此围绕头孢类抗生素进行的研究意义重大。

  C类β-内酰胺酶的迅速出现促使迫切地需要开发C类β-内酰胺酶特异性抑制剂以进行相对有效的临床治疗。为促进C类β-内酰胺酶抑制剂的开发，需要新的筛选C类酶抑制剂的方法。除了通过待筛样品与抗菌药联用的抗耐药菌常规筛选外[27-28]，目前关于C类β-内酰胺酶抑制剂筛选主要是基于荧光素标记[29]以及新型荧光探针[30]方法为主，但是该方法存在操作繁琐、筛选成本比较高、效率及普适性不高等明显缺陷，因此关于该方法的应用的报道并不多见。本研究通过优化建立的紫外-可见分光光度法，具有简便、可操作性强、稳定性高的特点，可实现AmpC酶抑制剂的快速检测和有效筛选，为筛选该类酶抑制剂候选化合物解决愈发严重的抗生素耐药性提供重要的方法支撑。

  本研究中AmpC酶抑制剂的快速筛选是在反应体系中添加样品（抑制剂）后，通过K值的变化来评价其抑酶活力的大小，其中温度、孵育时间、有机溶剂的类型、浓度以及产物等因素都会影响到酶促反应速率，进而影响筛选结果。因此，为了最大限度的避免上述因素对酶促反应的影响，本研究通过测定反应的初速度（V0）来评价。V0指在反应刚开始且上述因素尚未发挥作用时，时间进程曲线为直线部分时的反应速度，一般在约大于10%的底物被转化成产物之前对V0进行测定，以便将这类复杂因素的影响降至最低。本研究通过不同因素的比较优化，在设定的检测时间内，V0呈线性且相关性关系良好，最终证实本研究建立方法能用于AmpC酶抑制剂的筛选。

  在该AmpC酶抑制剂评价体系所确定的最佳反应时间内，酶和底物的浓度过高或过低都会影响整个反应的正常进行，不利于抑制剂的筛选。因此本研究优化了AmpC酶抑制剂评价体系的最适酶浓度和底物浓度，并且评价了不同有机溶剂对反应的影响，即当甲醇和乙醇的体积分数在30%以下，丙酮和DMSO在10%以下时对反应体系的影响较小。最终只有当整个反应体系的浓度适宜时，酶促反应才会趋于平稳状态，最终确定了最佳的筛选条件。

  受限于AmpC酶抑制剂筛选方法，目前关于该类酶抑制剂，尤其是以中药为资源系统的相关研究还较少见于文献报道。本研究根据上述所建立的AmpC酶抑制剂筛选方法对136种中药材进行活性评价，结果显示有12种中药水提取物AmpC酶抑制活性大于70%，5种中药水提物的抑制率大于80%，桑寄生（86.22%）和赤芍（85.30%）2种中药水提取物的抑制活性大于85%。尽管也有桑寄生醋酸乙酯萃取物具有抗菌的研究报道[31]，但是本研究通过酶抑制剂筛选的结果证实，桑寄生水提取物有着非常明显的协同抗菌活性，可明显提高青霉素的抗菌MIC值，显示了良好的进一步研究的价值，后期通过对其高活性部位活性物质的分离将有望获得拥有非常良好活性的抗耐药菌候选化合物。此外，本研究除了桑寄生水提物抑制活性最高外，其他4种水提取的酶抑制活性都大于80%，也进一步证实中药确然是新药发现尤其是抗耐药菌药物发现的良好资源，对其进行进一步的扩大筛选是必要的。

  来 源：罗满平，孟瑛瑛，李德民，王康旭，李媚媛，张新国，王宗元．AmpC酶抑制剂筛选方法的建立及136种中药材活性评价 [J]. 中草药, 2023, 54(19):6351-6361.返回搜狐，查看更加多