发布日期： 2024-06-08 14:33:37 来源：开云手机app平台
2,5-二甲基吡嗪（2,5-DMP）是一种杂环含氮化合物，是食品中重要的香气化合物。由于2,5-DMP具有增香作用，它作为食品制造业中的食品添加剂受到了广泛关注。2,5-DMP还被应用于制药工业，是生产降糖类药物和抗脂类药物的重要底物。L-苏氨酸是一种必需氨基酸，可用于食品增香剂、医药、饲料添加等方面。本研究拟挖掘鉴定出高活性的L-苏氨酸脱氢酶（L-TDH），试图以L-苏氨酸为底物采用全细胞催化法生产2,5-DMP，实现L-苏氨酸的转产增值，力争解决苏氨酸产能过剩问题。
南阳师范学院生命科学与农业工程学院的刘欣欣、王瑶、唐存多等拟以E. coli为出发菌株，从中调取L-TDH基因，再借助pACYCDuet-1质粒强化其在E. coli BL21（DE3）的表达，并对其酶学性质做多元化的分析，旨在为提高苏氨酸转化为L-2-氨基乙酰乙酸效率提供参考。
以E. coli的全基因组DNA为模板，Ectdh-F和Ectdh-R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2A所示，在约1 100 bp出现了明显的特异性条带，PCR产物片段与预期理论长度基本一致。将PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，用限制性核酸内切酶BamH I和Hind III进行双酶切，将酶切产物连接至经相同的限制性酶进行同样双酶切的pACYCDuet-1载体，转化至E. coli BL21（DE3）感受态细胞，再经氯霉素抗性筛选和双酶切验证，挑取重组子，用通用引物ACYCDuetUP1 Primer和DuetDOWN1 Primer进行PCR检测，结果如图2B所示，片段长度约1 100 bp，大小与其预期条带大小相符。将经PCR检测和双酶切验证的重组子送至苏州泓迅生物科技股份有限公司进行测序鉴定，获得Ectdh基因序列，并推测出其氨基酸序列。根据结果得出，EcTDH的序列及在载体上的插入位置与预期的结果相符，表明重组菌E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh已成功构建。
将上述推测出的EcTDH氨基酸序列在ProtParam（）上进行理论理化性质的预测，根据结果得出，EcTDH的理论等电点为5.81，理论分子质量为37 173.94 Da，不稳定指数II为24.46，是一个较稳定的蛋白，其在E. coli和酵母体内的半衰期分别能达到10 h和20 h以上。利用TMHMM-2.0服务器预测蛋白跨膜结构的结果为，EcTDH的所有氨基酸残基均为膜外残基，表明EcTDH理论上相当容易实现胞外分泌型表达。将EcTDH的氨基酸序列和已经报道来源不同的TDH氨基酸序列做多元化的分析（激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）、堀越热球菌（Pyrococcus horikoshii）、柯达热球菌（Thermococcus kodakaraensis）），用Jalview软件进行多序列比对，结果如图3所示，已报道的文献表明来自P. horikoshii的L-TDH氨基酸残基半胱氨酸Cys97、Cys100、Cys103、Cys111位在L-TDH中是保守的，其对应来自E. coli的L-TDH Cys93、Cys96、Cys99、Cys107。建立L-TDH的三维结构模型如图4所示，L-TDH对于底物L-苏氨酸的催化中心是在107位的半胱氨酸。
各重组子酶活力测定结果为，E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1的酶活力为0.24 IU/mL，而E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的细胞裂解液中检测到EcTDH活力可达到19.13 IU/mL，与本底细胞相比，其酶活力是E. coli本底细胞表达的79 倍，纯化后的比活力可达12.77 IU/mg，表明EcTDH表现出较高的酶活力。比较已有文献报道的不同来源的L-TDH活力结果如表3所示。能够准确的看出，来源于E. coli的L-TDH经载体pACYCDuet-1和pET28a表达后比活力产生较大差别，主要是由于酶活力定义不同，以及酶活力测定时底物和辅酶终浓度的差异导致，它们会对表观酶活造成较大的影响。文献报道测定酶活力体系中底物L-苏氨酸和辅酶NAD＋终浓度分别为100 mmol/L和200 mmol/L，而在本研究中终浓度分别为8 mmol/L和3 mmol/L。他们将每分钟消耗1mol NAD＋所需的酶量定义为1 U，而本研究将每分钟产生1 μmol NADH所需的酶量定义为1 IU。
由图6可知，在温度为20～45 ℃范围内，酶促反应速率随温度的升高而逐步的提升，超过45 ℃后，反应速率逐渐下降，表明EcTDH的最适反应温度为45 ℃，在40～45 ℃之间时具有较高酶活力。
如图7所示，在35 ℃和40 ℃保温120 min后的残留酶活力仍然高于90%，这表明它在35～40 ℃范围内有较好的稳定性。与之前文献报道的在35～40 ℃条件下测定的残留酶活力相比，本研究残留酶活提高了12.5%；在45、50、55 ℃残留酶活力达到50%所对应的时间分别为78、40 min和20 min。
由图8可知，重组酶的最适反应pH值在8.5～9.5之间，相对酶活力可达80%以上，EcTDH最适反应pH值为9.0。
如图9所示，重组L-TDH在pH 7.5～8.5的缓冲液中保持1.5 h后残留酶活力均能保持90%以上，表明它在pH 7.5～8.5范围内有较好的稳定性，其pH值适应性相对较广，在pH 8.5～10.0范围内残留酶活力在65%以上。
将分析纯的2,5-DMP在ThermoHypersil C18柱上进行HPLC分析，在该分析条件下，2,5-DMP的保留时间约为6.55 min，将2,5-DMP不同浓度对相应的峰面积进行线-DMP的标准曲线-DMP浓度对应的回归方程为y=2 062.4x＋354.29（x为2,5-二甲基吡嗪浓度（mmol/L）；y为峰面积，相关系数为0.9978），根据结果得出在该HPLC分析条件及浓度范围下，2,5-DMP浓度与峰面积呈良好线性相关。因此，利用此法可以对2,5-DMP进行精确定量分析。同样条件下对底物L-苏氨酸进行HPLC分析，底物的保留时间约为3.06 min。在相同的分析条件下，L-苏氨酸的保留时间与2,5-DMP保留时间差约3.5 min，根据结果得出在该色谱条件下可以在一定程度上完成L-苏氨酸与2,5-DMP的良好分离，该色谱方法能用来催化产物的分析鉴定。
对L-苏氨酸进行全细胞催化的生物转化。E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1和E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的催化产物经过离心取样后按照1.3.8节办法来进行HPLC分析，保留时间约为6.55 min和3.06 min处有明显的特征峰，它们与相同分析条件下2,5-DMP和L-苏氨酸标品的保留时间一致，表明在该催化条件下，部分L-苏氨酸已被转化成2,5-DMP。在不同时间取样分析、计算各时间节点的产物得率，它们的催化反应进程曲线 h，反应基本达到平衡状态，2,5-DMP得率基本不再随时间的变化而变化，E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh的产物得率约为12%，明显高于E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1的转化水平。根据结果得出，强化L-TDH的表达可明显提高2,5-DMP合成效率，但仅依靠强化TDH的表达难以实现L-苏氨酸的高效转化。
L-TDH是以L-苏氨酸为底物合成高值化合物2,5-DMP的关键酶，本研究对挖掘出来源于E. coli的L-TDH进行了高效表达及酶学性质分析。本研究从E. coli中克隆出L-TDH的基因片段，再借助pACYCDuet-1表达质粒在E. coli BL21（DE3）中实现了高水平的可溶性表达，酶活力测定根据结果得出，E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh发酵液中L-TDH活力可达19.13 IU/mL，纯化后重组L-TDH的比活力为12.77 IU/mg。与已报道文献相比，本研究表达水平和比活力均较高，比活力的差异可能归因于蛋白序列本身的差异，两者的序列相似度为77%；而表达水平的差异可能主要归因于宿主的差别，所用的E. coli表达系统比枯草芽孢杆菌表达系统具有更大表达潜力。也利用强化了TDH表达水平的重组E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-Ectdh进行了转化L-苏氨酸合成2,5-DMP的初步研究，它利用强化的TDH以及自身本底表达的NADH氧化酶、苏氨酸转运蛋白和氨基酸氧化酶等能够协同催化2,5-DMP的合成，反应24 h后产物得率约12%，明显高于没有强化TDH表达的E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1，这说明TDH确实在转化L-苏氨酸合成2,5-DMP的过程中起关键作用。然而，仅强化TDH表达难以实现L-苏氨酸的高效转化，后续研究需要参考前人的研究 ，充分的利用代谢工程和酶工程的手段，继续强化2,5-DMP积累正相关的基因表达，敲除2,5-DMP积累负相关的基因，以期进一步提升2,5-DMP的得率。
唐存多，副教授，南阳师范学院现代生物技术研究院副院长。1987年4月出生，湖南永州人，2008年6月毕业于苏州科技大学，获生物技术专业理学学士学位，2014年1月毕业于江南大学，获发酵工程专业工学博士学位。自2014年2月开始步入南阳师范学院工作，期间于2016年3月至2018年8月在华东理工大学许建和教授课题组进行博士后研究工作，主要是做于功能性食品添加剂及药物中间体的绿色生物合成相关的研究。近5年，以第一作者或通讯发表SCI论文13 篇，其中TOP期刊论文3 篇，授权发明专利3 项，获厅级科技成果一等奖3 项，主持国家自然科学基金项目、河南省青年科学家项目、河南省高校科学技术创新人才项目、河南省青年人才托举工程建设项目和河南省科技攻关项目等省部级以上项目5 项，完成成果转化2 项。多次获河南省优秀硕士学位论文指导老师、南阳师范学院最美教师、南阳师范学院优秀硕士生导师、南阳师范学院优秀员等荣誉称号。
刘欣欣，女，1998年4月出生，开封市祥符区人，南阳师范学院2021级生物与医药专业硕士研究生，目前的主要研究方向为： L-苏氨酸脱氢酶( L-threonine dehydrogenase, L-TDH)的异源表达及其酶学性质分析。目前以第一作者发表一篇EI、一篇SCI二区文章。
本文《大肠杆菌L-苏氨酸脱氢酶的高效表达及其酶学性质分析》来源于《食品科学》2023年44卷第18期85-92页，作者：刘欣欣, 王瑶, 史红玲,姚伦广，王贤，唐存多* 。DOI:10.7506/spkx1206-055。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：美娟；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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