发布日期： 2024-07-07 23:29:17 来源：新产品展示
聚合物的拓扑结构在决定其基因传递效率方面起着关键作用。因此，探索新的聚合物结构作为基因传递载体具备极其重大的意义。首次通过阶梯生长聚合方法合成了具有独特拓扑结构的新一代多环聚（β-氨基酯）s（CPAEs）。经过控制环化的发生阶段，得到了三种不同大小和拓扑结构的环的CPAEs。体外实验表明，与具有大环的转基因基因相比，具有大环的CPAEs（MCPAEs）明显提高了转基因的表达。此外，具有优化末端基团的MCPAE载体有效地传递了编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双引导sgRNAs的CRISPR质粒，用于基因编辑治疗。相关研究成果以“3D Macrocyclic Structure Boosted Gene Delivery: Multi-Cyclic Poly(β-Amino Ester)s from Step Growth Polymerization”为题于2023年7月25日发表在《Journal of the American Chemical Society》。
在本研究中，利用充分研究的季戊四醇四丙烯酸酯（PTTA）和5-氨基1-戊醇（S5）作为主单体（示意图1A），设计了三种阶梯式生长聚合（SGP）策略来调节三种不同环结构合成CPAEs的成环动力学（方案1B−D）。
示意图1 由不同的SGP方法产生的三种类型的CAPEs的化学结构和形成机理的示意图
环化过程的进展如图1A、B所示。当聚合物分子量（MW）接近二聚体时，63%的乙烯基被消耗，1h内的GPC痕迹如图1A、图1B红色虚线所示）。这个反应程度远高于理论二聚体假设没有环化反应44%的其他两种方法（图1C、F），表明在方法1中，在早期通过环化消耗了更多的乙烯基。随着聚合物链的生长，得到了具有不一样尺寸的环（随着聚合过程的进行而逐渐增大）的CPAEs（称为SMCPAE）。上述聚合过程如图1D所示。只有两个相距较远的官能团可以通过构象变化相互接触和反应，由此产生宏观环（称为MCPAE）。通过该方法，得到了CPAE-3进行表征（图1E中的2.5h）。
聚簇触发发射（CTE）的机制表明，CPAEs/HPAE中氧/氮原子之间的间距小于其范德瓦尔斯半径之和，导致有效的电子相互作用，导致非共价键的空间离域，延长有效共轭距离（图2D）。当在一张图像中观察三个CPAEs的PL图时，可以观察到它们的荧光行为之间的明显区别，从CPAE-1到CPAE-3可以观察到越来越显著的红移峰（图2E）。随着环尺寸的增大，更多的孤电子对基团将固定在更密集的环结构中，表现出更多的红移发射（图2F）。因此，与CPAE-2和-3相比，CPAE-1（由方法1制备）的小环结构能够最终靠ca325nm处的主要荧光峰来反映出来（图2A、F）。而在CPAE-2中也存在大量的中型环，这表明在ca430nm处出现了一个长波长的荧光峰（图2B、F）。对于CPAE-3C，它在ca450 nm处表现出一个主要的长波长发射峰，证实了宏观环在其循环结构中占主导地位（图2C、F）。
CPAE-1到CPAE-3的1H−1H相关光谱（COSY）光谱显示，CPAE-1和CPAE-2上的g（Hg）质子与E7上的b（Hb）质子耦合（图3A），这在某种程度上预示着CPAE-1和CPAE-2的末端基团和主干之间有很强的空间相互作用（图3B）。总相关光谱（TOCSY）显示了在CPAE-1和CPAE-2中，Hb（E7）和Hg（S5）上的校正耦合峰；然而，在CPAE-3的相应区域没有观察到这种相互作用（图3C）。这些根据结果得出，CPAE-1和CPAE-2的大部分末端基团嵌入在CPAE主干中，而以大环为主的CPAE-3，其大部分末端基团向外延伸，因此没有观察到与主干结构的相互作用。
与CPAE-1、CPAE-2和HPAE相比，聚合物/DNAw/w为120：1的CPAE-3在HEK细胞中的转基因表达分别提高了21倍、18倍和138倍（图4A）。此外，即使在最高的聚合物/DNA重量比（w/w = 200：1）下，所有细胞系中也没有观察到细胞毒性（超过90%的细胞活力）（图4B、D、E）。
PicoGreen检测结果为，所有PAEs的DNA结合效率均达到80%以上（图5A）。虽然不同的PAEs的DNA结合效率相似，根据动态光散射（DLS）评估，暂停的循环结构显著帮助浓缩复合大小相比分支结构同时保持高zeta潜力（图5B、C）。此外，CPAE多聚物的尺寸随着相应聚合物的环尺寸的增加而减小（图5C）。不同PAEs形成的多聚体大小的变化表明CPAEs的DNA缩合能力更强，特别是MCPAE。接下来还研究了不同PAEs的多聚体的CTE行为（图5D−F）。与PAE聚合物的荧光相比，其多聚物的荧光都降低了（图5D−F）。这些发现表明，环状结构，特别是宏观环状结构（MCPAE），更加有助于纳米级复合体的形成。根据Cy3标记DNA的荧光信号，能够正常的看到细胞内对宏环CPAE-3的摄取远超于其他PAEs；在处理4h后，它是SCPAE（CPAE-1）和HPAE-1的4倍以上（图5G）。由于MCPAE核的强度更强，CPAE-3在醋酸钠溶液中的降解速度比其他PAEs要慢得多（图5H）。由于MCPAE的结构更稳定，基于CPAE-3的多聚体表现出最慢的释放速率，在酸性条件下表现出其最好的DNA保护能力（图5I）。
从图6A、B中能够准确的看出，在保持80%以上的DNA包装效率和高表面电位的同时，随着宏观环化程度的增加，多聚体尺寸从MCPAE-0到MCPAE-72 h减少了70%。同时，从MCPAE-0到-72 h，复合体的摄取效率提高了16倍以上（图6C）。转染MCPAE-72 h后的GFP表达比MCPAE-0h增强了230倍，从分支结构过渡到大环结构，同时保持了超过90%的细胞活力（图6D、E）。这些结果进一步证明了CPAEs中大环结构的掺入有利于DNA包装、细胞摄取、DNA保护以及最终的基因转染。
基于方法3构建了终止于不同末端含胺基团的MCPAEs，首先对不同碳链长度的初级氨基做评估（图7A）。图7B中的转染结果为，随着末端碳链的延长，终止的MCPAEs的转染效果逐渐提高，并达到了末端基团C的最高性能。与HPAE-A到HPAE-D相比（图7C），MCPAE-A对MCPAE-D的转染性能要好得多，即使在最佳HPAE/DNA w/w比（200：1）下，MCPAE-C也达到HPAE的4倍。MCPAE-G的GFP表达量最高，超过了所有商业药物（图7D）。且三种MCPAE基本上没有细胞毒性，显示了它们在高效和安全的基因治疗方面的潜力（图7E）。
治疗性基因传递的主要障碍是它们的大序列大小，如CRISPR-EXON80质粒（图8A）。图8B的结果为，与MCPAE-C和MCPAE-M相比，MCPAE-G在测试的聚合物/DNA重量比范围内（从80：1到200：1），在保持高细胞活力的同时，表现出了更好的转染性能。因此选择了MCPAEG多聚体，并进一步应用于免疫细胞化学的Cas9的产生和定位研究（图8C）。在转染了CRISPR-EXON80质粒的HEK293细胞中，预期的编辑条带模式很明显，而在对照DNA中没有观察到这种情况（图8D）。对Sanger测序结果的CRISPR Edits（ICE）分析也证实了25%的DNA序列中存在58 bp的片段缺失（图8E）。
本文提出了一种新的环化阶段控制策略（方法1、方法2和方法3）来调节不同SGP阶段的环化趋势。该策略能够以可控的方式构建三种具有不一样环尺寸和循环拓扑结构的3D多循环PAEs。三种CPAEs具有独特的拓扑特征（包括不同的环类型和端群分布等），并首次用荧光光谱法和2D-NMR法进行了验证。三种CPAE的基因转染结果为，与其他CPAE和HPAE相比，大环PAE（MCPAE）及其多聚体明显地增强了DNA凝结、细胞摄取、DNA保护，来提升了转染基因的表达。表现最好的MCPAE-C、-G和-M比最好的商业试剂Lipo 3000、jetPEI和Xfect具有更高的转染效率。此外，利用优化末端基团的MCPAE，高效递送编码金黄色葡萄球菌Cas9核酸酶和双引导sgRNAs的CRISPR-EXON80质粒，用于体外基因编辑。本研究的发现为今后高效非病毒聚合基因传递载体的发展提供了有价值的见解。
声明：仅代表作者本人观点，作者水平有限，如有不科学之处，请在下面进行留言指正！
特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。
欧盟对上汽征收37.6%临时关税 上汽集团：将正式要求欧盟委员会就中国电动车临时反补贴税措施举行听证会 进一步依法行使抗辩权
张楚衣分享学习心态，分而治之刷题！不是一股脑的乱刷自己总结题型，答题方法
与中坚力量共成长，2024建信信托艺术大奖评委会特别奖获奖艺术家凌海鹏
初探苹果 tvOS 18 系统：Insight、支持21:9、史努比屏保
三星 Galaxy Buds3 / Pro 耳机更多实物图、渲染图曝光
首批华硕ROG NUC即将发售 配备英特尔CPU和NVIDIA RTX GPU