发布日期： 2024-06-22 09:47:09 来源：新产品展示
LncRNA 属于非编码基因，其功能涉及细胞凋亡、增殖、分化、代谢等多个生物过程
方法取1周龄SD大鼠骨髓，采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs 并传代，经成脂、成软骨和成骨诱导分化鉴定后，取第3代细胞分别采取了5%O2、 1%O2及无氧条件处理48 h，检测细胞活性、凋亡以及凋亡相关蛋白 ［低氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）］ 表达，以正常BMSCs作为对照，确定细胞凋亡最明显的浓度组用于后续实验。取缺氧处理48 h后BMSCs，通过基因芯片以及实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）分析，筛选表达下调最显著基因并构建其高表达、低表达以及阴性对照慢病毒并转染BMSCs，经qRT-PCR检测明确转染成功后，缺氧处理48 h观察细胞活性及凋亡相关蛋白表达。
结果经细胞活性、凋亡以及凋亡相关蛋白检测，以无氧条件培养48 h后细胞凋亡最显著，上述指标与其他组比较差异均有统计学意义（P0.05），以该组处理条件进行后续实验。基因芯片分析示缺氧处理48 h后，BMSCs中AC125847.1、LOC102547753、AABR07017208.2、LOC103693069明显下调，qRT-PCR检测LOC103693069表达下调最显著 （P0.05）；选择其构建慢病毒并转染BMSCs，qRT-PCR检测示成功转染至细胞；经缺氧处理后检测显示该基因高表达的BMSCs 凋亡率和凋亡相关蛋白表达明显降低（P0.05）。
近年来， BMSCs移植治疗缺血缺氧性疾病的体外研究已较多，并取得一定进展，但体内移植疗效尚不确切。有研究发现外源性BMSCs移植至体内后，在缺氧环境中会发生大量凋亡，严重影响了修复作用的发挥[1-2]。如何抑制BMSCs 缺氧性凋亡成为亟待解决的问题，学者们提出了缺氧预处理、改善线粒体功能、清除活性氧等方法来抑制细胞凋亡，但效果均不理想[3-4]。
长链非编码RNA（long non-coding RNA， LncRNA）是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，研究表明其对BMSCs基因表达具有广泛调控作用[5-6]，在缺血缺氧相关疾病中对细胞增殖、凋亡具备极其重大调控作用[7]。本研究以大鼠BMSCs为研究对象，筛选缺氧处理后下调最明显基因，并构建慢病毒转染BMSCs，观察细胞活性，探讨其对BMSCs缺氧性凋亡的影响，以期为调控BMSCs 缺氧性凋亡提供新思路。
1 周龄SD 大鼠30 只，雌雄不限，体质量10～20 g，由贵州医科大学实验动物中心提供。
L-DMEM 培养基、FBS、青链霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美国）；成软骨、成脂、成骨诱导培养基（Cyagen 公司，美国）；AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒（BD 公司，美国）；一步法逆转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技术有限公司）；油红O染液、阿利新蓝染液、 ALP染液（北京索莱宝科技有限公司）；低氧诱导因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、B 细胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）抗体（Abcam公司，美国）；线粒体膜电位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。
30只SD 大鼠腹腔注射1% 戊巴比妥溶液麻醉后，取双侧股骨及胫骨，采用L-DMEM 培养基冲洗骨髓至培养皿中；以离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min；弃上清液，取5 mL 含 10%FBS的L-DMEM完全培养基重悬后接种于25 cm2培养瓶中，于37℃、5%CO2 条件下培养，2～3 d后首次全量换液，以后每3天换液1 次。待细胞长满瓶底80%左右，予0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA进行传代。取第3代细胞诱导分化2 周后，经油红O、阿利新蓝和ALP染色鉴定具有成脂、成软骨和成骨分化潜能，培养细胞为BMSCs。取第3 代BMSCs进行后续实验。
1.3.1 实验分组及模型制备方法将BMSCs随机分为4组：对照组、5%O2组（5%CO2、90%N2和5%O2）、1%O2组（5%CO2、94%N2和1%O2）和无氧组（5%CO2、95%N2）。其中，对照组为正常培养细胞；各缺氧培养组采用细胞缺氧培养箱，通过气体监测器设置对应CO2、N2、O2 浓度培养，模拟体内缺氧条件[8]。
1.3.2 观测指标① CCK-8 法检测细胞活性：取BMSCs调整为浓度 1×105个/mL的细胞悬液，接种于96 孔板，每孔100 μL。按上述方法分组（每组3个复孔）并培养48 h 后，倒置荧光显微镜下观察细胞形态，按CCK-8试剂盒操作说明采用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度（A）值。
② 线粒体膜电位检测：取BMSCs调整为浓度1×107个/mL的细胞悬液，接种于共聚焦培养皿，每孔1 mL。按上述方法分组（每组3 个复孔）并培养48 h 后，PBS 洗涤3遍。取100 μL 10倍培养缓冲液加900 μL灭菌去离子水稀释，预热至37℃后吸取500 μL加入1 μL JC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液。取500 μL，JC-1工作液将细胞均匀悬浮， 37℃、5%CO2 培养箱孵育30 min，PBS 洗涤3遍；激光共聚焦显微镜下采集荧光，凋亡细胞呈绿色荧光，正常细胞呈红色荧光。Image J软件计算红/绿荧光比值，表示细胞凋亡情况。
③ 流式细胞仪检测：取BMSCs 调整为浓度5×104个/mL的细胞悬液，接种于T25 培养瓶，待细胞长满瓶底70%，按上述方法分组并培养48 h。以不含EDTA的0.25% 胰蛋白酶消化细胞后，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，然后依次加入5 μL AnnexinⅤ、5 μL PI，室温避光孵育5 min，轻轻涡旋细胞并室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
④ Western blot检测：参照流式细胞仪检测的新方法取细胞分组及培养48 h 后，加入含1% 蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，将蛋白与上样缓冲液混匀、加热，PAGE 凝胶电泳。用电转移仪将蛋白转移至PVDF膜，置于封闭液。加入一抗（HIF- 1α、 Caspase-3、Bcl-2）4℃孵育过夜，二抗孵育2 h；ECL 化学发光显影。以β-actin作为内参，目的条带与内参条带的灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次。
1.4.1 缺氧BMSCs 基因差异分析取经筛选浓度缺氧处理48 h 的BMSCs，通过基因芯片进行基因筛选，由上海吉凯基因科技有限公司完成。然后检索Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（），获得与BMSCs相关的微阵列。采用Limma 包分析BMSCs表达芯片，通过差异倍数（fold-change，FC）选择差异表达基因，筛选标准为log2 FC2和P0.05。采用pheatmap构建差异基因热图。
1.4.2 qRT-PCR检测对筛选出的表达下调基因进行qRT-PCR分析，选择下调程度最大基因。取BMSCs按1.3.1 方法分组并培养48 h，分别提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳测定总RNA量。采用miRNA逆转录试剂盒合成cDNA，65℃加热5 min 使逆转录酶失活。目的基因和GAPDH引物由上海生工生物科技有限公司合成。反应条件：95℃ 预变性3 min；95℃变性 3 s、60℃退火30 s，共45 个循环。采用2−ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量。
1.5.1 目的基因慢病毒构建筛选的目的基因慢病毒由上海吉凯基因科技有限公司构建，包括高表达、低表达以及阴性对照。
1.5.2 目的基因慢病毒转染BMSCs观测实验分为4组：正常对照组、阴性对照组、高表达组及低表达组。取第3代BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min，重悬调整为细胞浓度为1×105个/mL的细胞悬液；接种于25 cm2培养瓶中，每瓶5 mL。正常对照组不作特殊处理。阴性对照组、高表达组、低表达组分别加入相应的慢病毒原液100 μL以及Polybrane稀释液100 μL，混匀后于37℃、 5%CO2培养条件下培养；10 h后根据细胞状态更换L-DMEM 完全培养基，以后每2～3 天常规换液1次。
转染4～5 d 弃原培养基，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的L-DMEM完全培养基加压筛选24 h；随后，将嘌呤霉素浓度减至1 μg/mL维持筛选，传3代得到稳定株。qRT-PCR检验测试目的基因表达水平，观察其是否转染成功。
明确转染成功后，将上述各组细胞按照筛选的缺氧条件培养48 h后，参照1.3.2 方法观测目的基因转染对细胞活性及相关蛋白表达的影响。
采用SPSS19.0 统计软件做多元化的分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
培养48 h，倒置荧光显微镜下观察对照组及5%O2 组细胞呈长梭形，生长状态良好；1%O2 组、无氧组细胞部分老化、凋亡，边缘毛糙，折光性差。CCK-8法检测示，对照组、5%O2组、1%O2组、无氧组A值分别为2.00±0.02、1.92±0.02、1.39± 0.03、0.64±0.03；线粒体膜电位检测示，红/绿荧光比值分别为1.00±0.01、0.85±0.02、0.70±0.02、 0.40±0.03；流式细胞仪检测示，细胞凋亡率分别为3.27%±0.03%、3.32%±0.02%、42.1%±0.56%、70.2%±1.02%；Western blot检测示，随O2浓度降低，HIF-1α和Caspase-3 蛋白相对表达量逐渐上升，Bcl-2 蛋白相对表达量下降。见图1～4。
图 1 倒置荧光显微镜观察不同缺氧条件下细胞形态（×100）a. 对照组；b. 5%O2 组；c. 1%O2 组；d. 无氧组
图 2 激光共聚焦显微镜下观察不同缺氧条件下细胞荧光表达（×100）从左至右分别为红色荧光（正常细胞）、绿色荧光（凋亡细胞）、DAPI以及重叠图片a. 对照组；b. 5%O2组；c. 1%O2组；d. 无氧组
图 3 流式细胞仪检测不同缺氧条件下细胞凋亡情况a. 对照组；b. 5%O2组；c. 1%O2组；d. 无氧组
无氧组上述指标与其他组比较，差异均有统计学意义（P0.05），故选择以该浓度培养48 h 的BMSCs进行后续实验。
2.3.1 慢病毒转染后qRT-PCR检测与正常对照组比较，慢病毒转染后高表达组LOC103693069上调（14.23±1.21）倍，低表达组下调（9.22±1.14）倍，提示目的基因成功转染至细胞。
图 6 LOC103693069基因慢病毒转染BMSCs 后Western blot检验测试目的蛋白表达Mr：相对分子质量1：正常对照组2：阴性对照组3：高表达组4：低表达组
图 7 LOC103693069基因慢病毒转染BMSCs 观测a. 倒置荧光显微镜观察（×100）从左至右分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组；b. 流式细胞仪检测 从左至右分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组；c. 激光共聚焦显微镜观察（×100）从左至右分别为红色荧光（正常细胞）、绿色荧光（凋亡细胞）、DAPI以及重叠图片从上至下分别为正常对照组、阴性对照组、高表达组、低表达组
缺氧处理后，低表达组细胞凋亡率较阴性对照组增高，线粒体膜电位呈低红、高绿荧光，HIF-1α和Caspase-3蛋白表达上调、Bcl-2 蛋白表达下调；而高表达组逆转了上述结果，细胞凋亡率低于其他组，促进了BMSCs在缺氧条件下的存活。
本研究中通过体外模拟缺氧处理BMSCs，发现细胞大量凋亡，细胞活性明显降低，线粒体膜电位下降，HIF-1α和Caspase-3蛋白相对表达量上调， Bcl-2蛋白相对表达量下调。与既往研究报道的体外缺氧处理后BMSCs大量凋亡、凋亡相关蛋白表达增加结论[7]一致。然而，目前尚无最佳的改善BMSCs缺氧性凋亡方法，主要有调控活性氧、改善线粒体膜电位、调控HIF-1α表达等，但具体效果尚不确切[8-9]。因此，寻找有效的抗BMSCs 缺氧性凋亡方法具备极其重大意义。
近年来，随着对LncRNA研究的深入，慢慢的变多证据说明以往被认为是结构不完整、无功能的LncRNA，在机体多种生物学作用中发挥了强大调控作用，为改善BMSCs缺氧性凋亡提供了一种新思路和方法，也成为该领域的研究热点。我们采用基因芯片检测了缺氧凋亡BMSCs的相关基因表达，进一步行qRT-PCR 验证，最终确定LOC103693069在缺氧后表达下调最显著，且随着缺氧程度加重持续下调。有研究发现在缺氧状态下LncRNA表达异常，且在细胞功能调节中起着及其重要的作用[10-15]。结合上述研究结果提示LOC103693069 与BMSCs缺氧性凋亡密切相关。
LncRNA 属于非编码基因，其功能涉及细胞凋亡、增殖、分化、代谢等多个生物过程，特别是调控基因表达，慢慢的受到重视。研究显示LncRNA H19 通过抑制MAPK信号通路，促进肝癌细胞凋亡[12]；LncRNA CASC9通过稳定Nrf2的负调控因子miR-383-5P来减少Nrf2，从而在脊髓损伤神经元增殖中起关键调节作用[13]；LncRNA RN7SK通过抑制巨噬细胞形成基因的转录，来调控巨噬细胞极化和先天免疫反应[14]；LncRNA HOTTIP通过与多嘧啶束结合蛋白1相互作用，促进K-H型剪接调节蛋白水平，从而促进骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[15]。同样，我们在BMSCs缺氧模型中通过LncRNA芯片分析筛选得到LOC103693069 与BMSCs缺氧性凋亡紧密关联，过表达LOC103693069并缺氧处理后，BMSCs凋亡率和凋亡相关蛋白表达明显降低，当下调LOC103693069 时BMSCs凋亡率增加，相关凋亡蛋白表达上调，表明了过表达LOC103693069可抑制BMSCs 缺氧性凋亡。综上述，本研究证实了LOC103693069 可改善 BMSCs的缺氧性凋亡。