发布日期： 2024-05-27 18:41:17 来源：新产品展示
类器官是一种复杂的三维结构，包含了不一样的细胞。它可以克服传统二维细胞培养技术的限制。本研究提出了一种培养小鼠的肠道上皮类器官以及结直肠癌类器官的方法。我们从同一供体小鼠中分离出肠隐窝或者肿瘤组织，并将其培养在Matrigel®中。培养过程中添加了不同的生长因子，以模拟肠道干细胞的生态位，以便其可以有效的进行自我更新和分化。这种配对的类器官能够适用于药物的药理作用研究以及肿瘤选择性分析。
图形摘要：从化学AOM/DSS结直肠癌小鼠模型中生成的结肠配对类器官制备的示意性概述。
类器官是一种复杂的三维结构，源自多能干细胞或器官限制性干细胞。它们具有自组织和分化的能力，能够反映各自器官的关键功能和结构特性。过去几十年中，类器官培养已成为个性化和靶向治疗以及药物反应预测领域的重要模型。因此，类器官已成为生物医学和转化研究的不可或缺的一部分。
在研究结直肠癌的背景下，我们提出了一种生成小鼠配对类器官的方案，用于评估某些癌症药物的细胞毒性和肿瘤选择性。
肠类器官最早是由Sato等人在2009年建立的，利用小肠干细胞，在胶原基质中进行长期培养。随后，同一研究小组进一步开发了这一技术，可以从正常上皮和结肠肿瘤组织中培养类器官。
基于之前发布的肠道类器官方案，我们总结了生成小鼠配对类器官的修改后的分步方案。与之前的方案相比，个人会使用了三种不同的细胞系来生成适宜自我更新和增殖的条件培养基，包括Wnt3a、Noggin 和 Rspondin-1。此外，我们还提供了用于进一步分析药物处理的类器官的详细方案，如RNA和蛋白质分离、形态定量、使用碘化丙啶/Hoechst 33342进行膜通透性染色，以及基于ATP的细胞活力测定。
注意：使用 mNoggin-Fc、mRspondin-1-Fc 或 mWnt3a 进行基因修饰的 HEK293T 细胞表达目的蛋白并将其分泌到培养基中。这种条件培养基是用于类器官培养的培养基的重要组成部分。
解冻每种 HEK293T 细胞系的一个等分试样，将其转移到 10 mL 相应的培养基中，然后在 500℃ 下离心 5min。
将沉淀重悬于 5 mL 培养基中，并将悬浮液转移至含有 25 mL 生长培养基（总共 30 mL）的 T175 烧瓶中。
当细胞正确贴壁后（通常在 1-2 天后），必要时加入抗生素做出合理的选择（sAB）（mNoggin-Fc 细胞 = 500 µg/mL GeneticinTM; mRspo1-Fc 细胞 = 300 µg/mL ZeocinTM；mWnt3a 细胞 = 无 sAB）。
当细胞达到约80%的融合度时，用PBS洗涤，将所有细胞分至新的烧瓶（p1），并进一步胰蛋白酶化，直到细胞脱离培养皿；稀释细胞并将其放入新的T175烧瓶中（1:3-1:4）。
在所有 mNoggin-Fc 和 mRspo-1-Fc 细胞的烧瓶中加入 sAB。
当细胞达到 80% 融合度时，再次以 1:3 或 1:4 的比例将细胞分成第 2 代（p2）。 注意：更高的稀释度也能够得到更多的细胞。
对于条件培养基（CM），细胞一定要达到 100% 的融合度。 重要提示：切勿将 sAB 加入条件培养基的烧瓶中。 注意：若需要进一步培养细胞，请仅向这些细胞/培养瓶中添加抗生素。
当细胞达到100%的融合度时，去除培养基，加入50 mL的Ad+培养基（不含选择抗生素）。
在至少培养5-7天后，将要通过 0.22 µm 过滤器过滤的相应细胞系的条件培养基 (CM) 汇集到无菌瓶中并等分。为避免瓶顶真空过滤器凝固，可将 CM 转移至 50 mL 试管中，并在过滤前于 4°C 下以 800 × g离心3 分钟（以沉淀并去除非贴壁细胞）。
剩余的培养瓶可用于至少3-6代，以重复这一过程，产生更多的条件培养基。
注意：一些研究人员仍使用抗生素（使用 sAB）培养第 2 代 (p2)，直到细胞达到 100% 汇合。重要的是，Ad +培养基必须不含选择抗生素 (NO sAB)。
B.通过斑点印迹分析，测定条件培养基（CM）中Rspondin-1和Noggin的数量（图2）。
如果需要，为斑点印迹准备相应的IgG标准品的稀释系列。 标准Rspondin-1：正常小鼠IgG1，Santa Cruz，目录编号： SC-3877。 标准Noggin： InVivoMAb人IgG1同型对照，bxcell，目录号： BE0297。 IgG标准的推荐稀释度（IgG Stock 0.2 mg/mL）：从0.2到0.025 mg/mL，在5% BSA中加入TBS-T（0.1%Tween®20）。
解冻每个条件下的Noggin和spdin-1培养基，准备稀释系列。在TBS-T中用5% BSA稀释：未稀释-1:2-1:4-1:8-1:16。
通过切割约7 × 9 cm大小的印迹，两个硝化纤维素膜，可在50 mL管中孵育。用铅笔画线，以指示要应用斑点的位置。
将 2 µL 样品或标准品点在相应的膜上。通过非常缓慢地施加溶液/点来最小化面积。找出所有样品、标准品和阴性对照。
将取样的硝化纤维素膜转移到盒子或培养皿中，盖上盖子，让膜干燥（几个小时或一夜）。
通过将膜在封闭溶液（TBS-T中）中室温孵育30- 60 min来阻断非特异性位点。
取出阻断液，与HRP偶联的二抗[抗人HRP（mNoggin-Fc）或抗小鼠HRP（mRspo1-Fc），均为1：10000在阻断液中]孵育30 min。
我们使用点印法（Dot blot analysis）来估计Rspondin-1（Rspo1）和Noggin在条件培养基中的含量。将未稀释（undil.）和稀释的条件培养基点印在膜上，并为了定量，将相应的标准物质也点印在每个膜上。Rspo1的标准物质为正常小鼠IgG1，Santa Cruz，编号#71。Noggin的标准物质为人类Fc片段，InVivoMAb人类IgG1同位素对照，编号#72。未经过条件处理的Ad+培养基用作空白。
注：1)对于TOPFlash检测，能够正常的使用一个可转染良好的细胞系，如H1299细胞。
TopFlash 测定中使用条件培养基 (CM)，以估计培养基中 Wnt3a 的活性。因此，用 TOP 或 FOP 质粒转染细胞并与 CM Wnt3a 一起孵育。未条件化的Ad +培养基用作空白对照。
注：结肠配对类器官制剂是指从同一受体产生肿瘤来源和正常上皮来源的类器官。如前所述，使用化学物质azaxa甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结直肠肿瘤（Tanaka等，2003；Becker等，2005；Klemke等，2021）。
为了最大限度地降低污染风险，请在开始之前对所有使用过的工具做消毒或灭菌。
为了最大限度地降低污染风险，PBS 可以补充抗真菌药物，例如两性霉素、抗生素，例如青霉素/链霉素，或组合药物溶液，例如抗生素抗真菌剂（例如，来自 Thermo Fisher）。
当使用新鲜的基质凝胶时，可以在4°C冰上缓慢解冻过夜，然后分装1.5 mL或2 mL的试管中。在使用前，将基质胶等份在冰上解冻至少一小时。
基质凝胶应始终保存在冰上。在生物安全罩下，有不同的可能的方法来处理基质凝胶。为了获得最佳无菌状态，可使用可消毒的凝胶填充冷却袋或冷却架进行冷却。装满冰块的可消毒桶或盒子更容易处理，但污染风险更高。
基质凝胶在使用前通常能在冷培养基中稀释至15-20%，这取决于基质胶批次的蛋白质浓度和刚度。应注意批次差异（蛋白质浓度应高于 9 mg/mL，内毒素含量应低于 1.5 EU/mL）。
完全切除肠道或单独切除任何肠段。 注：在这些步骤中采用的最佳无菌性可最大限度地减少培养过程中的污染风险。为便于操作，使用针或插管将鼠标仰卧位连接在可消毒的切割板或聚苯乙烯泡沫板上。在用剪刀打开皮肤之前，给皮毛消毒。为了达到最佳的无菌效果，小心地将皮肤与腹壁分离，以防止腹膜穿孔。用新的剪刀，打开腹膜腔。
用镊子取出肠系膜，把小肠切成更小的、更容易处理的部件（例如，大约是培养皿的直径）。将肠道部分放入冷的PBS中，适当地标记为小肠和大肠（结肠）。
对于结肠肿瘤的制备，解剖几个肿瘤，将它们转移到冰冷的 PBS 中，并将它们切成小碎片。
对于正常的小肠和结肠上皮制剂，用盖玻片轻轻地刮去多余的粘液或残留的粪便。
从肠道中切出正常的肠道碎片。小心并避免解剖有肿瘤上皮组织的部分。将肠碎片切成约 2 mm × 2 mm 的小块。（例如先纵向切割一次，再横向切割一次，用刀片引导，用手术刀切割。）
将碎片转移到一个装满约15 mL冷PBS的50 mL管中。从现在开始，总是在冰上工作。
13.无论如何，如有必要，请向管中添加最多 50 mL 的冰冷 PBS。
17.再次在 4°C 下以 500 × g离心管5 分钟。小心吸出全部上清液并将管置于冰上。
注：每个基质凝胶®圆顶的体积[µL]是常规培养的近似值或建议，能够准确的通过特定的实验有必要进行调整（表1）。
表 1. 针对不一样板格式使用推荐的 Matrigel ®和培养基体积的细胞悬浮液。
注：1) 为了最大限度地降低污染风险，请在开始之前对所有使用过的工具做消毒或灭菌。
2) 为了最大限度地降低污染风险，所有类器官培养基都可以额外补充抗真菌药物，例如两性霉素，或组合抗真菌/抗菌药物溶液，例如抗生素抗真菌剂（例如，来自赛默飞世尔）。
3) Matrigel ®应始终保存在冰上或以其他方式冷却。为了最大限度地减少 Matrigel ®损失，移液器吸头可在 -20°C 下预冷。将适量的 Matrigel ®（表 1）添加到颗粒中，轻轻混合直至颗粒完全分散。避免在Matrigel®中产生气泡。
4)通常，制备一只小鼠后，分离足够的隐窝和肿瘤细胞，在6孔板中培养隐窝1-2孔，在6孔板中培养2-3孔肿瘤细胞。
在预热过的6孔板中，每孔接种200µL的细胞悬液（一孔接种8滴25µL）。孔的数量取决于分离产量和所需的体积和细胞密度。
每孔加入2 mL预热过的类器官培养基，在37°C、5%CO2的条件下培养。
根据您的实验有必要进行培养和处理。 注意：请记住，Matrigel ®可能会保留处理溶液。圆顶上的介质和处理痕迹不易被冲走。因此，必须彻底清洗处理：吸出上清液后，用预热的 PBS 执行初始清洗步骤。添加培养基并在 37°C 下孵育至少 30 分钟。然后，再次更换介质。第二天再次更换培养基，进一步减少处理痕迹。
通过用 PBS 预填充外排孔并在 37°C 培养箱中预热板来准备 96 孔平底培养板。
继续播种。每孔接种 10 µL 类器官悬浮液。小心地将液滴播种到孔的中心，莫接触孔壁。对于初学者来说，能够最终靠在播种前将装载的移液器在孔底部敲击一次而不弹出进行深度定向来提高精度。 注意：更大的体积会增加可用于实验的类器官的数量，但也会增加液滴粘附在孔壁上的风险，因此必须将其排除在分析之外。
对每个孔重复步骤 2 和 3，在每个接种孔后分配悬浮液，以防止接种密度不均匀。
2) 如果吸力仍然损坏Matrigel ®圆顶，能够最终靠堆叠塑料移液器吸头逐步降低功率。
注意：对于小肠类器官培养，建议在大约 4-7 天后进行分流；对于结肠和肿瘤类器官培养，建议在 6-8 天后进行分流，分流比例为 1:2 或 1:3，具体取决于接种密度和关于播种前的物理破坏。
将悬浮液转移到含有5-10 mL冷PBS的50 mL管中。如果仍有含有类器官的基质凝胶®，则再次用冰褶PBS冲洗孔。
加入 3 mL 冰冷的 PBS，用力上下移液 20 次。对于较长的分裂间隔或较小的碎片，请使用 1 mL 移液器上下移液 40 次。为了获得最佳的机械破坏和最小的破坏，请将蓝色移液器吸头对角地放置在管底部的侧面，而不是直接放置在中心。或者，能够正常的使用连接到 5 mL 血清移液器上的 200 µL 移液器吸头进行机械分离。 注：为了更好的提高基质凝胶®的去除，建议在步骤6之后，在2 mL的细胞恢复液冰液中孵育10 min。离心管500×g，4°C，5 min，吸上清液。如果在第7步后类器官片段仍然太大，类器官也可以在结肠4 mM EDTA溶液和小肠5 mM EDTA溶液中孵育，在4°C的滚筒上孵育30 min，接着进行额外的机械破坏。
再次在500 × g下在4°C下离心5分钟。仔细抽吸完整的上清液，将装有细胞颗粒的管子放在冰上。仔细吸入整个上清液，并将细胞颗粒放在冰上。
注：为了验证正常结肠类器官没有被肿瘤来源类器官污染，可以平行接种一个正常结肠类器官，并在没有Wnt3a条件培养基的相关类器官培养基中培养。肿瘤的类器官可以在没有Wnt3a的情况下生长，而正常的结肠类器官则不能生长，这可当作一种功能控制。此外，正常结肠来源的类器官在形态上不同于肿瘤来源的类器官。从图形摘要中能够正常的看到，正常的结肠来源的类器官（绿色）显示出较厚的隐窝样上皮层，而肿瘤来源的类器官（红色）为圆形，有一层薄薄的上皮层。
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