发布日期： 2024-02-03 06:55:29 来源：GC法检测
“微生物群-肠-脑”轴的实现在神经精神疾病，特别是抑郁症中起着关键作用，对此的研究也正在迅速推进。苦参碱是一种天然的生物活性化合物，已被发现具备潜在的抗抑郁作用。然而，口服苦参碱治疗抑郁症时调节“微生物群-肠-脑”轴的潜在机制仍然不清楚。它的抗抑郁作用最初是通过行为测试和单胺类神经递质的相对水平来评估的，并且我们观察到苦参碱能减轻CUMS诱导的小鼠的抑郁样行为并增加神经递质含量。随后，咱们进行了从“肠道”到“大脑”的研究，包括通过16S rRNA测序检测肠道菌群组成；进行肠道代谢物的代谢组学检测及差异代谢途径分析；通过ELISA试剂盒或免疫荧光评估二胺氧化酶、脂多糖、促炎细胞因子和脑源性神经营养因子 (BDNF) 的相对水平。结果我们得知，苦参碱能调节肠道菌群和代谢产物的紊乱，恢复肠道通透性，减轻肠道炎症，以此来降低外周血循环和脑区促炎细胞因子水平，最终增加脑内BDNF水平。苦参碱能够最终靠调节“微生物群-肠-脑”轴来缓解小鼠CUMS 引起的抑郁症。
1.苦参碱治疗减轻了CUMS诱导小鼠的抑郁样行为并促进了单胺类神经递质的释放
在慢性轻度不可预见性应激（CUMS）诱导4周后，我们给小鼠灌胃不同浓度的苦参碱2周。接下来进行体重、行为测试（蔗糖偏好测试（SPT）、强迫游泳实验（FST）、旷场实验（OFT）和新奇抑制摄食实验（NSFT））和单胺类神经递质的水平，以检查苦参碱的抗抑郁作用。如附加文件1：图S1所示，在CUMS诱导4周后，小鼠的蔗糖偏好率在第4周显着降低（padj = 9.52e-04），表明CUMS建模成功。同时，30 mg/kg (padj = 8.94e-04) 和60 mg/kg (padj= 0.03) 苦参碱在第6周显着增加了蔗糖偏好的减少（ANOVA：SPT，F = 17.36 , df = 5, p = 5.01e−06)。结合前人研究结果，我们最终选定苦参碱30 mg/kg作为后续实验的最佳剂量。
为了探索能改善抑郁症的苦参碱对肠道微生物群的影响，我们对小鼠盲肠内容物中的微生物进行了16S rRNA测序分析。我们比较了α多样性，发现每对组之间没有显着差异（附加文件 1：图 S2）。我们进一步分析β多样性，PCoA 显示样本在很大程度上是按组分开的，这在某种程度上预示着不同处理组的肠道微生物群有显着差异，除了苦参碱组和对照组之间（PERMANOVA：Con-CUMS：F =3.47，padj = 0.012；CUMS-CUMS + IMI：F = 2.74，padj = 0.006；CUMS-CUMS + MA：F = 4.31，padj = 0.006；Con-CUMS + MA：F = 1.62，padj = 0.144；图 2A）。同时，UPGMA 聚类进一步表明CUMS和CUMS+IMI 组之间的差异从Con和CUMS+MA组分支出来，虽然Con和CUMS +MA 组聚集在一起（图 2B）。上述根据结果得出，苦参碱对CUMS诱导小鼠肠道菌群的影响更接近于对照组。
图2不同人群肠道菌群的多样性和组成。A，根据Bray-Curtis距离绘制的不同组中β多样性的主坐标分析(PCoA)图。提供了前两个轴解释的方差百分比，分别占18.2%和8.8%。B，基于Bray-Curtis相异矩阵的带算术平均值的未加权对组法(UPGMA)。根据PERMANOVA (padj 0.05)，具有不一样字母的组显着不同。C，堆积圆中的分类树。圆圈从外到内代表门、纲、目、科和属。不同处理组中每个ASV的丰度显示为饼图。D，门级前十名ASV的相对丰度。E，属水平前十名ASV的相对丰度。F，基于线性判别分析效应量分析，分支图显示LDA分数大于2的ASV。
每组肠道微生物群组成的平均相对丰度概况如图2C所示。厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门是所有组中最丰富的门，占总细菌群落的90%以上（图 2D）。在属水平上，与对照组相比，CUMS组中乳杆菌和异杆菌的相对丰度显着降低，同时文肯菌属和Odoribacter的相对丰度显着增加（所有padj = 0.02；图 2E）。与CUMS组相比，苦参碱处理组乳杆菌属（padj= 8.16e-04）相对丰度增加，而螺杆菌属、文肯菌属、Odoribacter和瘤胃球菌属的相对丰度显着降低（所有padj = 0.03）。有必要注意一下的是，在相对丰度前10的属水平发生显着变化的微生物群中，乳杆菌、异杆菌、Turicibacter、双歧杆菌和瘤胃球菌是革兰氏阳性菌，而Oscillospira、螺杆菌属、文肯菌属、Odoribacter和Desulfovibrio是革兰氏阴性菌。CUMS步骤将革兰氏阳性菌的总相对丰度降低了50%以上，而所有革兰氏阴性菌的相对丰度都上调了。然而，苦参碱处理逆转了这种情况，表明苦参碱治疗调节了 CUMS 诱导的抑郁症小鼠的肠道微生物群组成。
基于 LEfSe，我们分析了驱动不同处理组之间肠道微生物群组成差异的ASV，共鉴定了四组之间的27个差异ASV（LDA 2.0），其中11个在属水平（图 2F）。结果显示属水平的不同ASV集中在CUMS组。具体而言，CUMS组中Odoribacter、文肯菌属、乳球菌属、链球菌属、Anaerotruncus、梭菌属、CC-115和螺杆菌属的相对丰度与其他组有显着差异。乳酸杆菌和 Denitromonas 在苦参碱组中含量最多。对照组中的主要ASV是异杆菌。经过分析，我们得知 LEfSe 中的差异 ASV（属水平前 50）是Odoribacter、文肯菌属、乳杆菌、链球菌属、Anaerotruncus、梭菌属、异杆菌、Denitromonas、螺杆菌属。上述小鼠肠道菌群的组成和丰度在不同组间的变化特别显示在附加文件1：图S3中。
肠道微生物组成的改变会导致肠道代谢物的变化，于是我们进一步探讨了苦参碱对肠道代谢物的影响。首先，我们采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）对对照组、CUMS组和苦参碱组的代谢物做多元化的分析，根据结果得出三组之间有明显差异（图3A，B）。
图3不同组别肠道代谢物的组成和差异，以及代谢途径分析。A、B，对照组、CUMS模型组和苦参处理组的PCA和OPLS-DA分析。C、E，差异代谢物的VIP值图（VIP值前20）。D、F，KEGG差异代谢途径图（代谢途径的前20个命中数）。
为了找到各组之间的差异代谢物，我们在OPLS-DA中筛选了VIP 1和p 0.05的组合。在比较对照组和CUMS组后，我们最终选择具有VIP值的前 20 种差异代谢物进行显示（图 3C）。与对照组相比，CUMS组4种差异代谢物含量显着升高，16种差异代谢物含量显着降低。同样，CUMS模型组和苦参碱处理组之间前20个VIP值的差异代谢物如图3E所示。与模型组相比，苦参碱处理后16种差异代谢物含量显着升高，组胺等4种代谢物含量显着降低。有必要注意一下的是，组胺与炎症的发生紧密关联，富集的代谢途径是炎症介质调节TRP通道。令人兴奋的是，在附加文件 1: 表 S2中，我们得知苦参碱处理后除谷氨酸-缬氨酸-精氨酸，色氨酸(O)-异亮氨酸、UDP-D-半乳糖、焦谷氨酸-色氨酸-精氨酸、苏氨酸-甘氨酸-赖氨酸、苯丙氨酸-苯丙氨酸和丝氨酸-苏氨酸-赖氨酸可以逆转。这反映出苦参碱逆转了CUMS诱发的抑郁症小鼠肠道代谢物的大部分变化。
除了VIP值排名前20的差异代谢物外，我们还发现了7种与氨基酸代谢相关的差异代谢物：L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和L-谷氨酰胺。L-苯丙氨酸可转化为L-酪氨酸，进而转化为NE和DA。L-色氨酸是5-HT的合成前体，其在肠道中的相对含量与肠道炎症呈负相关。除了降低肠道通透性外，L-谷氨酰胺还能够大大减少炎症并形成较为强大的肠道屏障。如附加文件1: 图S4所示，与对照组相比，模型组7种代谢物水平呈下降趋势。这种氨基酸紊乱的趋势在苦参碱处理后得到逆转，证实了苦参碱对单胺类神经递质的正向调节作用，暗示了肠道通透性破坏和炎症的可能。
此外，为了了解肠道差异代谢物的潜在分子功能，咱们进行了代谢途径分析。图3D、F分别显示了对照组和CUMS组、CUMS组和苦参碱组之间的差异代谢途径（前20个命中）。其中，有14条相同的代谢途径，即：ABC转运蛋白、氨基酸的生物合成、嘧啶代谢、神经活性配体-受体相互作用、氨酰-tRNA生物合成、蛋白质消化吸收、半乳糖代谢、维生素消化吸收、癌症中的中心碳代谢、矿物质吸收、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、突触小泡周期和催乳素信号通路，这标明苦参碱可恢复CUMS引起的大部分异常代谢途径。
为了探索抑郁症相关指标和肠道相关指标之间的相关性，我们对肠道代谢物、肠道微生物群和抑郁样行为进行了Spearman相关性分析（附加文件 1：图 S5）。我们得知上述指标之间有显着相关性，表明苦参碱对CUMS诱导小鼠抑郁样行为的改善作用涉及肠道微生物群和代谢物的调节和恢复。然而，苦参碱影响肠道菌群和代谢产物治疗抑郁症的可能相关机制有待进一步证实。
4.苦参碱降低肠道通透性标志物并降低CUMS诱导的抑郁样小鼠的LPS 水平
苦参碱能够减少CUMS诱导的抑郁样小鼠肠道通透性标志物，并降低LPS水平。由于CUMS诱导小鼠肠道内出现了革兰氏阴性菌（如Odoribacter、文肯菌属、螺杆菌等），并改变了氨基酸及其代谢产物（如L-色氨酸、组胺、L-谷氨酰胺等），这些与肠道屏障损伤和肠道炎症紧密关联。血清中肠道通透性标志物二胺氧化酶（DAO）的ELISA结果证实，CUMS组的DAO相对含量（图4A，padj= 0.04）明显高于对照组，表明CUMS诱导小鼠的肠道通透性增加。由于LPS是革兰氏阴性菌的重要成分，因此我们检测了LPS的相对水平。血清中LPS的结果为，CUMS组的LPS明显高于对照组（图4B，padj= 5.68e−04），表明CUMS组的小鼠有几率存在肠道炎症，然后将LPS释放到血液中。然而，苦参碱处理逆转了DAO（padj = 0.03和padj = 0.006）和LPS（padj = 7.42e−04和padj = 5.13e−04）水平的增加（ANOVA: DAO，F = 5.76，df = 3，p = 0.003; LPS，F = 19.87，df = 3，p = 3.25e−06），表明苦参碱具有抗炎作用，能恢复肠道通透性和LPS的相对水平。
5.苦参碱降低了CUMS诱导的抑郁样小鼠外周血循环和特定脑区中促炎细胞因子的水平
我们进行了Spearman相关性分析，以评估特定脑区（前额叶皮层和海马）中差异肠道微生物群、差异肠道代谢物、促炎细胞因子以及特定脑区BDNF表达水平之间的关联。肠道菌群在属水平前10和LEfSe差异中选择，差异代谢物在图 3C、E 中选择前10。如图6所示，前额叶皮质和海马的BDNF水平与乳杆菌和异杆菌的丰度呈正相关，与幽门螺杆菌、文肯菌属和Odoribacter的丰度呈负相关。前额叶皮层和海马区促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平与乳杆菌和异杆菌丰度呈负相关，与螺杆菌、文肯菌属和Odoribacter丰度呈正相关。前额叶皮层和海马BDNF水平与纤维二糖、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸、N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸、谷氨酸-缬氨酸-精氨酸、N6、N6、N6-三甲基-L -赖氨酸、色氨酸(O)-异亮氨酸、4-吡哆酸、谷氨酰胺-色氨酸-精氨酸、焦谷氨酸-色氨酸-赖氨酸、甲硫氨酸-缬氨酸-赖氨酸、丝氨酸-天冬酰胺-赖氨酸、组氨酸-甲硫氨酸-精氨酸和焦谷氨酸-色氨酸-精氨酸的含量呈正相关，同时与4-吗啉丙磺酸阿坎酸、阿坎酸、(N-(-2-乙酰氨基))-2-氨基乙磺酸、L-瓜氨酸、吡哆醛和乙酰磷酸的含量呈负相关。更重要的是，前额叶皮层和海马区促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）水平与上述差异代谢物的关系与BDNF与上述差异代谢物的关系恰好相反。总的来说，相关性分析结果进一步提供了肠道和大脑相关指标之间的关系，表明苦参碱通过“肠-脑”交流改善了CUMS诱导的小鼠抑郁症。
图6肠道和大脑相关指标之间的Spearman相关性。坐标轴标签：红色，前额叶皮层和海马体中的BDNF和促炎细胞因子；蓝色，肠道菌群；黑色，肠道代谢物。左下方区域的数字：相关系数的值；右上角符号：相关性和显着性检验结果，*p 0.05, **p 0.01, ***p 0.001。
先前的证据说明，苦参碱具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和神经保护特性。然而，大剂量生物碱具有显着的肝毒性和神经毒性，这在某些特定的程度上限制了其临床应用。我们在研究中选择的苦参碱剂量在其体内安全剂量范围内 (10–160 mg/kg)，充分避免了其毒性。在目前的研究中，为阐明苦参碱的抗抑郁作用，我们建立了CUMS与分离相结合的动物模型来模拟人类长期低强度应激引起的抑郁症，成功建立了小鼠抑郁症模型，并通过四种行为测试（SPT、FST、OFT 和 NSFT）和血清中单胺类神经递质（5-HT、NE 和 DA）的检测证明了这一点。在本研究中，四种行为测试被用于评估小鼠的快感缺乏、行为绝望、运动和探索能力及食欲。
研究表明，长期的压力会导致肠道菌群失衡，而经典的抗抑郁药可以缓解肠道菌群的改变。暴露于压力的抑郁模型小鼠的抑郁样行为也与肠道微生物组成的变化有关。在我们的研究中，CUMS模型组的肠道微生物群结构确实发生了显着变化，表现为Odoribacter、文肯菌属、链球菌属、Anaerotruncus、梭菌属和螺杆菌属的相对丰度显着增加，但经过苦参碱处理后这一趋势发生逆转。众所周知，在CUMS后，Odoribacter的相对丰度显着增加。肠道中的Odoribacter与脑源性神经营养因子、脑和肠道紧密连接蛋白水平呈显着负相关，并且与大脑和肠道中的炎症细胞因子水平以及多种代谢和自身免疫性疾病的促炎状态显着正相关。文肯菌属与肠道紧密连接蛋白（如occludin和e-cadherin）显着负相关，与炎症细胞因子显着正相关，与肠黏膜屏障及炎症程度有关。有研究发现重度抑郁症患者肠道中链球菌和梭菌属的相对丰度明显高于正常人。链球菌属于促炎菌，其相对丰度的增加会诱发肠道炎症。 Anaerotruncus与焦虑呈正相关，据报道其在应激动物的粪便中增加，在肠屏障功能障碍的小鼠粪便中增加。此外，据报道幽门螺杆菌感染可能会引起胶质细胞产生炎症产物，影响神经营养因子的产生。在属水平上，移植了抑郁样小鼠粪便菌群的小鼠体内幽门螺杆菌的丰度比其他组更显着。此外，乳酸杆菌是对照组中的一种差异微生物群（图 2F）。众所周知，乳杆菌属是肠道中的一种益生菌，有利于减轻肠道炎症，改善各种神经系统疾病。总的来说，我们观察到CUMS组微生物群显着增加的大部分已被证实与炎症和神经系统疾病，尤其是抑郁和焦虑呈正相关。然而，苦参碱调节和恢复了与抑郁小鼠炎症相关的肠道微生物群的组成，这表明苦参碱介导肠道微生物的调节以改善抑郁样行为。
代谢组学作为一种系统的研究方法，直接反映了机体生化过程和状态的变化，对药理和疾病模型具有鉴别和确证作用，能更好地捕捉药物引起的内源性代谢产物的变化。与预期一致，CUMS过程导致大多数代谢物发生显着变化（图 3C、E）。由此，我们进一步预测其可能参与和影响的代谢途径。经过分析，我们得知与抑郁症治疗紧密关联的代谢途径有4条，即ABC转运蛋白、氨基酸生物合成、神经活性配体-受体相互作用和突触小泡循环。据报道，ABC 转运蛋白与抑郁症有关。事实上，一些ABC转运蛋白分布在整个大脑中并参与血脑屏障以调节各种代谢物的流入或流出。有必要注意一下的是，在图 3D、F 的共有代谢途径中，氨基酸的生物合成具有更高的影响。此外，氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成、丙氨酸以及天冬氨酸和谷氨酸代谢也发生明显的变化，再次验证肠道氨基酸代谢紊乱与抑郁症的病理生理紧密关联。此外，神经活性配体-受体相互作用的上调有助于CUMS诱导的抑郁症的恢复。有必要注意一下的是，从结果来看，神经活性配体-受体相互作用通路的上调有利于补偿低突触小泡周期，从而促进神经递质的释放以改善CUMS引起的抑郁症。这些报道与我们的实验结果相吻合，也为揭示苦参碱的抗抑郁机制提供了理论依照。因此，我们推测CUMS过程导致小鼠氨基酸代谢功能障碍，而苦参碱治疗通过多种代谢途径减轻CUMS手术引起的代谢紊乱和相关症状，从而改善抑郁症。
无论如何，我们的研究证实，多种氨基酸及其代谢物的显着变化与肠道屏障和炎症有关。鉴于以上结果，我们大家都认为有必要进一步研究苦参碱对反映肠道炎症和通透性指标的影响。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌的一种成分，可通过与CD14 Toll样受体 4（TLR4）结合诱导IL-1β的产生，然后IL-1β刺激其他促炎细胞因子的产生（如TNF-α和IL-6），进而促进肠道炎症的发生，破坏肠道屏障，导致肠道通透性增加。肠道屏障功能的下降伴随着DAO的增加，DAO是肠道通透性的标志。因此，我们检测了DAO、LPS的相对水平。此外，促炎细胞因子能够最终靠第二信使或内皮细胞穿过血脑屏障，在中枢神经系统和周围神经系统之间进行双向通信。因此，我们接下来测试了前额叶皮层和海马以及小鼠血清中促炎细胞因子的相对水平，发现苦参碱能恢复肠道通透性和肠道屏障功能，调节肠道和外周血循环中促炎细胞因子的释放，减轻特定脑区的炎症损伤。这一结果与苦参碱的抗炎作用及其对乳杆菌等肠道菌群的调节密不可分。
值得注意的是，在抑郁症模型小鼠中，大脑中促炎因子水平升高导致神经营养因子释放受损。此外，神经炎症促进抑郁症患者和抑郁症模型动物BDNF 表达的下调。BDNF是神经营养因子家族的主要成员之一，对神经发生和抑郁症的发病机制至关重要。在我们的研究中，苦参碱对BDNF的作用确实与促炎因子的作用相反，这表明苦参碱的抗抑郁机制涉及通过调节炎症因子最终上调BDNF蛋白表达。此外，Spearman相关性分析证实了实验结果，并进一步支持苦参碱通过“肠-脑”调节改善抑郁样行为。然而，双向“肠-脑”交流的因果关系尚未得到证实。下一步，我们将进行粪便菌群移植实验，验证苦参碱通过“肠-脑”调节改善抑郁症的因果关系，这对于进一步探索其抗抑郁机制具备极其重大意义。此外，已知苦参碱通过抑制各种神经系统疾病中的神经炎症和氧化应激而表现出神经保护作用。此外，它可以通过多种信号通路调节线粒体功能和细胞间通讯。未来，我们将深入研究苦参碱抗抑郁作用的直接靶点和相关分子机制，进一步探讨氧化应激和细胞间通讯参与“肠-脑”通讯发挥抗抑郁作用的可能性。
总之，我们的研究证实，苦参碱能调节肠道微生物群的组成和肠道代谢产物的紊乱，恢复肠道通透性，减少外周血循环和神经炎症，增加BDNF蛋白的表达，从而有效缓解CUMS诱导小鼠的抑郁样行为。本研究为探索苦参碱通过“菌群-肠-脑”轴改善抑郁症的机制提供了依据，为苦参碱治疗抑郁症提供了新的方向。我们未来的工作将开展粪便微生物群移植实验，以验证苦参碱通过“肠-脑”调节改善抑郁症的因果关系。
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