【48812】依托咪酯经过调控miR‑214‑3pTBL1XR1分子轴按捺脂多糖诱导心肌细胞炎症及凋亡

  依托咪酯经过调控miR‑214‑3p/TBL1XR1分子轴按捺脂多糖诱导心肌细胞炎症及凋亡

  依托咪酯经过调控miR‑214‑3p/TBL1XR1分子轴按捺脂多糖诱导心肌细胞炎症及凋亡

  1中山大学中山眼科中心海南眼科医院（海南省眼科医院）麻醉科，海南省眼科学要点试验室，海口 570311；2海南省人民医院麻醉科，海口 570311

  本研讨首要讨论依托咪酯是否经过调控微RNA（miR）‑214‑3p/转导素β1X连锁受体蛋白质1（TBL1XR1）分子轴影响脂多糖（LPS）诱导的心肌细胞炎症及凋亡。

  依托咪酯、LPS、大鼠心肌细胞H9c2、RIPA裂解液、兔抗鼠TBL1XR1抗体、辣根过氧化物酶（HRP）符号的山羊抗兔二抗、凋亡试剂盒。

  心肌细胞H9c2置于含有10%胎牛血清的培育基内，于37℃、体积分数5%CO2培育箱培育24 h。心肌细胞接种于96孔板（5×104个/孔）。

  随机将心肌细胞分为5组（每组3个复孔，每组试验重复3次）：正常对照组（Con组）、脂多糖组（LPS组）、脂多糖+20 μmol/L依托咪酯组（E‑L组）、脂多糖+50 μmol/L依托咪酯组（E‑M组）、脂多糖+100 μmol/L依托咪酯组（E‑H组）。Con组正常培育，LPS组参加含有浓度为1 mg/L LPS的DMEM培育液培育24 h，E‑L组、E‑M组、E‑H组分别运用不相同浓度（20、50、100 μmol/L）的依托咪酯与浓度为1 mg/L LPS的杜氏改进培育基（DMEM）培育24 h。

  搜集各组细胞培育上清液，依照试剂盒说明书检测TNF‑α、IL‑6、IL‑1β水平。

  搜集各组心肌细胞参加预冷PBS洗刷后弃上清，向细胞沉积中参加500 μl结合缓冲液重悬细胞，依照凋亡试剂盒说明书检测细胞凋亡率。

  选用Trizol法提取各组心肌细胞总RNA。参照反转录试剂盒将总RNA组成cDNA。依照荧光定量PCR试剂盒说明书操作检测miR‑214‑3p、TBL1XR1 mRNA相对表达量。

  取各组心肌细胞参加500 μl RIPA裂解液，冰上孵育30 min后离心10 min，提取细胞总蛋白，蛋白质变性，选用SDS‑PAGE别离蛋白，转膜，用5%脱脂牛奶关闭2 h，参加Bax（1∶1 000）、Bcl‑2（1∶1 000）、TBL1XR1（1∶500）与内参甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）（1∶1 000）一抗稀释液与二抗稀释液（1∶5 000），暗室内曝光显影，运用Image J软件剖析各条带灰度值。以意图蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值的比值表明意图蛋白相对表达量。

  与Con组比较，LPS组细胞凋亡率和Bax水平升高、Bcl‑2蛋白水平下降（P0.05）；与LPS组比较，E‑L组、E‑M组、E‑H组细胞凋亡率和Bax水平下降、Bcl‑2蛋白水平升高（P0.05），且呈剂量依靠性；E‑L组、E‑M组、E‑H组细胞凋亡率及Bax、Bcl‑2蛋白水平差异均有统计学含义（P0.05）。见图1、图2、表2。

  2.5搅扰miR‑214‑3p表达可削弱依托咪酯对LPS诱导的心肌细胞炎症及凋亡的按捺作用

  本研讨成果为，LPS处理后心肌细胞炎症因子TNF‑α、IL‑6、IL‑1β的水平十分显着升高，与相关文献报导成果类似。进一步剖析显现，不同浓度的依托咪酯处理后心肌细胞炎症因子TNF‑α、IL‑6、IL‑1β的水平下降，且跟着运用剂量的添加而显着下降，提示依托咪酯可按捺LPS诱导的心肌细胞炎症反响从而减轻细胞损害。炎症反响可引起细胞凋亡从而加剧细胞损害，本研讨成果为LPS处理后心肌细胞凋亡率十分显着升高，Bax表达上调，Bcl‑2蛋白表达下调，而不同浓度的依托咪酯处理后细胞凋亡率显着下降，Bax表达下调，Bcl‑2蛋白表达上调，且呈剂量依靠效应，提示依托咪酯可能会按捺LPS诱导的心肌细胞凋亡。

  本研讨证明，miR‑214‑3p可靶向结合TBL1XR1，LPS处理后心肌细胞中miR‑214‑3p的表达水平显着下降，TBL1XR1的表达上调，而不同浓度的依托咪酯处理后心肌细胞中miR‑214‑3p的表达上调，TBL1XR1的表达下降，搅扰miR‑214‑3p表达能够削弱依托咪酯对LPS诱导的心肌细胞炎症及凋亡的按捺作用。