发布日期： 2024-06-29 14:27:12 来源：开云手机app平台下载
siRNA转染实验慢慢的变成了分子生物学研究常做的实验之一，但很多研究者对于siRNA转染结果的判断还存在模糊认知，以至于无法准确判定siRNA的转染效率和目标基因mRNA或蛋白表达水平的敲低效果。本文将从siRNA转染阳性率、基因沉默效率和蛋白表达水平三方面来分析说明如何准确判断siRNA转染结果。
siRNA转染阳性率一般是通过研究者转染带荧光标记的阴性对照，再用荧光显微镜观察转染进siRNA并呈现出点状荧光的细胞比例来判断。观察前，应用PBS清洗两遍细胞培养板，将含有转染复合物的培养基洗去，否则在镜下观察时会因为荧光背景太强而无法清晰看到转进细胞内的荧光点。这一点很重要，很多研究者没有清洗就去观察荧光，往往会因为背景太强看不到转进去的荧光点就误认为没有转进去。还有，如果不进行清理洗涤，细胞表面会吸附荧光标记的siRNA和细小的荧光颗粒，有时又会导致错误的转染阳性判断。另外，我们实验室发现，很多没有显微镜使用经验的研究者往往调不好显微镜焦距，细胞内尽管有很多荧光点却观察不到，常常将转染阳性误认为转染阴性。
需要特别指出的是，siRNA转染阳性率只是判断siRNA转染结果的初步指标，并不是判断siRNA转染效果的金标准，判断siRNA转染效果的金标准无疑是目标基因mRNA的敲降水平。显然，siRNA转染阳性只是表明siRNA被转染进了细胞，无法反映siRNA被转染进细胞后能否被有效释放和产生目标mRNA敲降作用的情况。有些研究者出于简单易操作的考虑，仅仅通过siRNA转染阳性率去判断siRNA的转染效率显然是错误的。
特别必须要格外注意的是，在标记siRNA转染实验中，细胞内荧光的强弱并不具备判断意义。有些研究者认为，细胞内荧光强表示siRNA转染效率高，这是比较错误的认知。事实上，有些转染试剂如PEI、阳离子脂质体类试剂，转染siRNA后胞内荧光往往很强很亮，但是在检测基因沉默效率时，mRNA的敲降效果却很低。出现这样一种现象的机理是，阳离子脂质体或PEI类转染试剂往往带有较多的正电荷，通过静电引力吸引了较多的荧光标记siRNA，转染进细胞后由于脂质体或PEI不能很快降解，并不能高效地将静电吸引的siRNA释放，导致标记siRNA聚集，从而使荧光看起来很强。但是，由于不能将siRNA高效释放，虽然荧光很强，但目的基因mRNA干扰水平却很低，无法达到理想的研究效果。因而，研究者以转染的荧光强弱来判断siRNA转染效果往往会得出错误的结论。实际上，真正高效的siRNA转染呈现的荧光应该是有些折光、分散于细胞质的点状荧光，RNAiMAX、 Rfect V2等比较高效的转染试剂的转染结果均是如此，而Lipo2000、国内部分转染试剂呈现的转染结果大多数都是荧光很强但敲除效率却不高。
图1. RFect V2转染FAM-NC至原代大鼠主动脉平滑肌细胞，荧光呈点状，略带折光，分散于细胞质内，中间没荧光的部分为细胞核。
如上所述，转染阳性率只是一个直观的表象指标，目的是用来初步判断转染试剂能否将siRNA转进细胞，但研究者无法通过该数据来获得准确的siRNA转染结果。想要准确判断siRNA转染结果还得看“金标准”，即是目标mRNA的敲降水平，也称基因沉默效率。那么，检测基因的沉默效率必须要格外注意哪些方面呢？
“金标准”的可信度和准确度要建立在转染后低细胞死亡率的基础上，因为死亡细胞的这部分也会表现为目的基因mRNA表达水平的降低。因此，研究者要选择低细胞毒性的siRNA转染试剂进行实验，如RNAiMAX、RFect V2等，以规避试剂毒性对转染结果带来的负面影响。
基因沉默效率的检测时间很重要。研究者最好在siRNA转染后24h~48h之间进行检测，由于细胞会分裂增殖，对于mRNA敲降水平的检测结果有影响，因而检测时间最晚不建议超过72小时。
RT-qPCR检测中，合理设置内参十分关键。内参能够有助于使检测的样本量中各种影响因素趋于均质化，而不会导致实验结果出现过大的偏差。但要注意的是，实验中内参基因不能是阳性对照所要敲降的基因，如实验中的阳性对照为siGAPDH，则内参要选择细胞中其它表达量稳定的管家基因，否则实验的设置和结果就会出现问题，这点可能会被一些实验者忽略。
siRNA转染后引起目的基因mRNA的降解，继而影响其蛋白水平的表达，这是被大家广泛所认知的一个科学事实。分子生物学的中心法则就描述了这种从DNA到RNA再到蛋白的基因表达过程：由DNA先转录成mRNA，然后再翻译成蛋白的氨基酸链。也正是鉴于mRNA和蛋白之间的这种关系，多数人都会存在一个误解，认为目的基因mRNA表达水平和蛋白表达水平是一致的，所以当发现WB检测结果显示蛋白水平没有出现显著变化时就产生了自我怀疑。其实不然，虽然两者存在必然的影响关系，但是并不一定会表现出完全一致的结果。一方面，在基因表达的过程中，存在着转录水平调控、转录后调控、翻译后调控等多种调控机制，甚至细胞中的信号通路可以通过翻译后修饰（如磷酸化、泛素化等）来快速改变蛋白质的活性，而不必改变蛋白质的总量，所以造成蛋白水平高、低或者无显著变化的原因就可能是多方面的。另一方面，蛋白水平检测时间的设置也很重要，由于转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔，并且受细胞内目的蛋白表达量、稳定性、半衰期、甚至其他调控等因素的影响，所以蛋白质水平下降的幅度与mRNA水平下降不一定成线性正比关系。通常情况下，在siRNA转染后48小时进行WB检测，但每个实验中目的蛋白水平的变化快慢并不相同，研究者可采用多点采样的方式来监测蛋白水平的变动情况，以便于更加详实地进行实验数据的分析。